二羟环氧苯并芘短期暴露对人支气管上皮细胞基因表达谱的影响

王慧，吕懿，李玲，李朝菲，郭璨璨，田凤㛃，穆箭兵，郑金平,3

1.山西医科大学公共卫生学院卫生毒理学教研室，山西 太原 030001

2.美国国立卫生研究院，马里兰州 贝塞斯达 20892

3.长治医学院公共卫生与预防医学系，山西 长治 046000

苯并［a］芘（benzo［a］pyrene，BaP）是生产与生活环境中的主要污染物之一，我们的前期研究发现，职业暴露于BaP的焦炉工人表现出以通气功能障碍为主的肺功能损伤［1］，可能与肺部的炎症反应和氧化应激相关。近年来多项有关BaP毒性机制的研究也证明，用BaP或其在体内形成的活性代谢产物二羟环氧苯并 芘（7，8-dihydrodiol-9，10-epoxidebenzo［a］pyrene，BPDE）染毒细胞，4～24 h即可引起细胞信号转导紊乱、细胞周期异常、能量代谢异常以及氧化损伤，最终导致细胞的生存率明显下降［2-3］。BaP可能通过直接作用和在体内形成活性代谢产物BPDE两种途径引起肺损伤。因此，深入研究BPDE引发细胞急性损伤的分子机制，能为提出早期防控措施提供线索。本研究通过BPDE短期暴露细胞模型，在转录组水平观察BPDE对人支气管上皮细胞（16HBE细胞）基因表达的影响，为进一步探讨BaP致肺损伤的毒性机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞培养与分组

将16HBE细胞（中国广州吉妮欧）加入细胞培养基培养于37℃、5% CO2的培养箱中。细胞培养基由89%最低必需培养基（minimum essential medium，MEM；美国Gibco），10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS；中国武汉普诺赛） 和1%的青链霉素混合液（中国武汉普诺赛）配置而成。BPDE（加拿大Toronto Research Chemicals）呈黄色固体状，纯度为95%，溶解于有机溶剂二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO；中国北京索莱宝）作为母液，待细胞生长达80%时分为实验组（终浓度为0.5、1.0、2.0、4.0 μmol·L-1BPDE）和溶剂对照组（等体积DMSO，终浓度≤0.1%）及空白对照组（正常培养基），处理24 h后，用CCK8法检测细胞存活率。根据各组细胞存活率，选取2.0 μmol·L-1染毒组和溶剂对照组进行后续的测序实验。所有实验重复3次。

1.2 CCK8细胞毒性实验

按每孔2×104个细胞密度将16HBE细胞接种于96孔板中，待细胞进入对数生长期，按“1.1”分组为空白对照组、溶剂对照组和实验组（4个染毒浓度），每组设置3个复孔，更换含有BPDE或DMSO的培养基继续培养24 h。随后每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育1 h后用DNM-9602G酶标分析仪（中国北京普朗新）在450 nm波长处检测各孔光密度值（D值），计算各组细胞活力，实验重复3次。记录结果，计算实验组与对照组的细胞存活率，细胞存活率=［（D实验-D空白）/（D对照-D空白）］ × 100%。

1.3 RNA提取和mRNA库的构建

选取2.0 μmol·L-1染毒组和溶剂对照组，细胞染毒处理24 h后弃去培养基，加入磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS），用细胞刮棒在冰上收集细胞，并进行细胞计数，使细胞量不低于每组1×106个。取适量细胞样品转入TRIzol裂解液（美国Invitrogen）中。平放静置5 min，使细胞充分裂解。高速低温离心机（德国Eppendorf） 4℃，12 000×g离心5 min，将上清转移到含有0.3 mL氯仿∶异戊醇（体积比24∶1，西陇化工，中国）的EP管中。用力混匀15 s，4℃，12000×g离心10 min。将含有RNA的上水相转移至等体积异丙醇的新管中，4℃，17 500×g离心25 min。弃去上清后，用1 mL 75%乙醇洗涤RNA沉淀2次，4℃，17 500×g离心3 min，弃上清，短暂离心后去除残留液体，在生物安全柜（新加坡ESCO）中风干10 min。最后加入DEPC水（美国Ambion）30 μL溶解沉淀。使用Nano Drop（美国Thermo Scientific）进行总RNA浓度和纯度的测定，随后由武汉华大医学检验所有限公司通过BGIseq500平台（中国深圳BGI）完成测序。该研究的相关结果数据已收录在国家基因库生命大数据平台（China National GeneBank DataBase，CNGBdb）的国家基因库序列归档系统（a data repository for archiving omics data，CNSA），项目编号为CNP0001418。

1.4 数据过滤和比对

使用SOAPnuke（v1.5.2）［4］对测序数据进行过滤，使用HISAT软件［5］将经过滤得到的读长序列（clean reads）比对到参考序列，参考物种是来源于美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的人类（参考基因组版本：GCF_000001405.38_GRCh38.p12）。应用Bowtie2（v2.2.5）软件［6］将clean reads与参考编码基因集比对。

将大数据分析和挖掘技术引入，使视频监控系统变被动为主动，从海量数据进行有效的信息提取，完成变电站设备的精益化安全管理。通过对站内设备信息的提取结合大数据技术，分析设备的当前状态和运行趋势，从而进行有效的风险预判。同时，通过大数据的挖掘，结合变电站运维巡视制度，可以自动形成变电站远程巡视的电子报告，实现替代人工到站巡检方式，提高巡视效率。因此，将大数据技术与传统视频监控相结合，应用到变电站运维值守中，可以实现运维策略优化和远程安全管控。

1.5 差异表达基因的筛选

用RSEM （v1.2.12）［7］计算基因表达量。按基因在不同样本中的表达情况，用pheatmap（v1.0.8）绘制热图。采用基于负二项分布原理的R包DESeq2（v1.4.5）［8］（http: //bioconductor.org/packages/stats/bioc/DESeq2/） 进行两组样本间的表达差异分析，以|log2FC| ＞ 1，P＜ 0.05为标准筛选差异表达基因。

1.6 生物信息学分析

使用基于超几何检验的Phyper函数（https: //en.wikipedia.org/wiki/Hypergeometric_distribution）对基因本体论（Gene Ontology，GO）（http: //www.geneontology.org/）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）（https: //www.kegg.jp/） 注释的不同表达基因进行富集分析。Bonferroni法通过P值对达到统计学差异的基因的基因功能和信号通路进行校正，P值为0.05。基因共表达网络分析使用华大基因提供的内部定制数据挖掘系统Dr.Tom方法。

1.7 统计学分析

用SPSS 21.0软件对数据进行统计学分析，计量资料结果以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t法。在SAS 9.4软件中采用Cochran-Armitage方法进行趋势检验。检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 CCK-8法检测细胞活力

随着BPDE染毒剂量增加，细胞存活率呈下降趋势（Z=-7.79，P趋势＜ 0.01）。0.5、1.0、2.0、4.0 μmol·L-1染 毒组细胞存活率分别为94.56%±1.74%、84.80%±3.19%、80.08%±1.72%、62.72% ±1.90%，低于溶剂对照组（98.61%±0.61%）和空白对照组（100%），差异有统计学意义（P＜ 0.05）。

2.2 测序数据质量评估

通过BGISEQ平台进行测序，样品比对基因组和基因集的平均比对率分别为92.72%、68.95%。相关性分析表示，各样本间基因表达水平相关性良好，不存在偏差过大的样本。主成分分析显示，各个样本能较好地与同类聚在一起。在mRNA测序中Reads的每个位置上A碱基和T碱基比例相等，G碱基和C碱基比例相等，则表明测序没有偏好性。低质量（Quality ＜ 20）的碱基比例较低，说明测序质量较好。

2.3 差异基因统计

用DEseq2方法筛选差异表达基因，以|log2FC| ＞ 1，P＜ 0.05为筛选标准，与对照组相比，染毒组共筛选出191个两倍及以上差异表达的基因；其中，上调基因87个，下调基因104个。差异表达在两倍及以上的mRNA共1 548个；其中，上调670个，下调878个。结果见图1。上调和下调基因名称如表1所示。

2.4 差异表达基因的生物信息学分析

从细胞组分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和生物过程（biological process，BP）三个方面对差异基因的功能进行标准化的分类，如表2所示。上述基因主要涉及细胞器、细胞膜和细胞外区域等组分的构成。同时具有分子结合、催化活性等分子功能，如蛋白结合、RNA结合、核酸结合和NADH脱氢酶等。此外主要参与翻译过程、细胞周期和线粒体功能等生物学过程，如氧化还原过程、翻译、翻译起始和RNA聚合酶II的转录调控等。

图1 差异表达基因的聚类热图（A）及火山图（B）Figure 2 Clustered heat map of differentially expressed genes (A) and volcano plot (B)

表1 BPDE急性染毒肺细胞中差异表达的基因Table 1 Differentially expressed genes in lung cells infected with BPDE

对差异表达基因进行KEGG富集分析，结果见表3。主要相关通路及参与的基因如表2所示，分别有集落刺激因子CSF2-17信号通路、军团杆菌病、丁酸甲酯代谢、沙门氏菌感染、细胞因子-细胞因子受体相互作用、趋化因子信号通路、疟疾、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染等，与炎症发生相关。

表2 差异表达基因GO功能分析Table 2 GO function analysis of differentially expressed genes

续表2

表3 差异表达基因和mRNA 的KEGG通路分析Figure 3 KEGG Pathway analysis of differentially expressed genes and mRNA

续表3

2.5 基因共表达网络分析

对发生两倍及以上表达改变的基因进行共表达网络分析。发现关联强度最大的一组基因，如图2所示。其中趋化因子CXCL6、CXCL1、CXCL3、CXCL8和集落刺激因子CSF2显著富集于IL-17信号通路，并与JAK3共同参与趋化因子信号通路，CSF2还与沙门氏菌感染有关并参与肿瘤坏死因子信号通路，详情参见表4。

图2 基因共表达网络分析Figure 2 Gene co-expression network

表4 差异基因富集最具统计学意义的通路Table 4 The most significantly enriched pathways of differentially expressed genes

2.5 差异表达mRNA的生物信息学分析

从转录水平筛选差异表达的mRNA，并通过GO功能注释和KEGG通路分析探究其参与的生物学过程和信号通路。GO结果显示，差异表达mRNA主要参与膜、细胞核、细胞质、核质等的构成。并且与蛋白结合、核酸结合、转移酶活动、核苷酸结合、水解酶活性、DNA结合等功能相关。同时还与RNA聚合酶II对转录的调控、染色质组织、磷酸化作用、细胞周期、伪足组装的正向调节、凋亡执行器的负调控等生物学过程有关，见表2。KEGG通路分析共得到319条相关通路，以P＜ 0.05为标准筛选最具统计学意义的是铁死亡通路，包含12个mRNA，对应8个基因，分别是ACSL4、ACSL5、FTL、GCLM、NCOA4、SLC11A2、SLC39A14、SLC7A11。其余主要相关通路有调控干细胞多能性的信号通路、赖氨酸退化、群体感应、磷脂酶D信号通路、人类乳头瘤病毒感染、脂肪酸生物合成等（表3）。

3 讨论

BaP作为多环芳烃类化合物的代表，是广泛存在的环境污染物。BaP进入机体后形成活性代谢产物BPDE，BPDE与DNA、蛋白质等大分子加合，可引起DNA损伤［9］及表观遗传改变，蛋白质转录表达异常，信号转导通路紊乱，进而导致细胞功能障碍，细胞生存率下降。本研究通过探讨BPDE可能引起的细胞转录组谱改变，筛选出在BPDE染毒早期出现表达谱差异的分子标志，为揭示BPDE致肺细胞损伤的分子机制，提出早期防控措施提供指导。

在BPDE的细胞毒性研究中，国内外学者一般选择的染毒剂量在0.2～10 μmol·L-1之间［2，10］。我们首先通过检测BPDE干预24 h对16HBE细胞生存状态的影响，初步判断BPDE染毒是否引起细胞表型改变。结果显示，16HBE细胞的生存率随着BPDE染毒剂量的增加而降低。我们在光镜下观察到，2 μmol·L-1BPDE染毒组的细胞形态基本正常，仅可见细胞排列紊乱等轻微变化，细胞存活率（80.08%±1.72%）较对照组明显降低（P＜ 0.01）。为进一步探讨BPDE通过干预基因表达改变导致细胞存活率下降的可能机制，我们选择了能导致存活率下降但仍保持80%以上，细胞形态没有出现严重损伤的2 μmol·L-1BPDE剂量染毒并进行转录组测序研究。

转录组测序筛选到差异表达倍数在两倍及以上的基因191个，其中上调基因87个，下调基因104个。通过KEGG通路分析，筛选出的主要相关通路包括IL-17信号通路［11］，丁酸甲酯代谢、趋化因子信号通路等。近年研究发现，IL-17信号通路在宿主防御、组织修复和炎症疾病中发挥重要作用，与自身免疫性疾病、代谢紊乱和癌症等密切相关。我们的生物信息分析结果还提示可能涉及军团杆菌病、沙门氏菌感染、疟疾、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染，而在这些非特异性通路中包含的CXCL8、CXCL3、CXCL1、HSPE1-MOB4等基因正是IL-17通路中的相关基因，说明BPDE主要是引起了细胞应激反应和炎性改变。趋化因子主要在感染或损伤过程中发挥作用，表达增加时可以促使白细胞向损伤部位迁移［12］。集落刺激因子CSF2的增加能够刺激粒细胞、T细胞增殖，增强粒细胞和巨噬细胞功能，起到抗感染作用［13］。趋化因子通路里的JAK3基因主要在免疫细胞中表达，在本研究中也发生了明显的上调。JAK3所编码的蛋白质是一种受体酪氨酸激酶，是JAK/STAT信号通路的重要成员，许多细胞因子如干扰素IFN、白介素IL-2、生长因子EGF等都通过该信号转导途径活化，诱导细胞的增殖、分化和凋亡［14］。IL-17信号通路中的趋化因子和CSF2表达升高，JAK3上调活化可能与BPDE致肺支气管上皮细胞炎性损伤机制有关。

考虑到不同基因对应的mRNA数目不一定相同，因此对差异mRNA做了进一步分析。GO富集显示，差异表达mRNA主要富集在生物学过程中的凋亡执行期负调控、细胞外信号转导负调控等。KEGG富集分析发现具有统计学意义的通路共有319条。其中最引人注目的是铁死亡信号通路，在具有统计学意义的通路中排列第一位，它包含12个mRNA，对应8个基因，分别是ACSL4、ACSL5、FTL、GCLM、NCOA4、SLC11A2、SLC39A14、SLC7A11。铁死亡是一种跟铁离子有关并伴随脂质过氧化发生的程序性死亡方式，谷胱甘肽（glutathione，GSH）耗竭、铁离子蓄积、活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平升高是铁死亡的特征性标志［15］。胱氨酸/谷氨酸逆向转运体（xc-系统）由轻链xCT（SLC7A11）和重链 4F2（SLC3A2）组成，对GSH的合成至关重要。BPDE对SLC7A11表达的影响可能造成GSH合成不足，从而导致GPX4活性下降，导致ROS水平升高。酰基辅酶A合成酶长链家族成员 4（acyl-CoA synthetase long-chain family member4，ACSL4）参与磷脂酰乙醇胺的生物合成和重塑，影响多不饱和脂肪酸的跨膜，BPDE诱发ACSL4表达上调，可增加脂质过氧化的底物在细胞内聚集而促进铁死亡。细胞内铁离子的积累与输入过多、排出减少，以及储铁蛋白的功能障碍有关。铁以三价铁（Fe3+）进入血液循环，通过转铁蛋白和转铁蛋白受体进入细胞内的内涵体，随后经金属还原酶还原成二价铁（Fe2+），二价铁通过二价金属离子转运体DMT1（SLC11A2） 和锌指蛋白ZІP8/14（SLC39A14）进入细胞质；铁蛋白轻链（FTL）和铁蛋白重链储铁能力下降时，铁离子释放。内涵体和铁池释放的铁通过Fenton反应导致铁死亡发生。因此，BPDE对SLC11A2、SLC39A14和FTL表达的影响可能通过影响铁离子代谢参与细胞铁死亡机制。核受体共激活因子4（nuclear receptor coactivator 4，NCOA4）作为铁蛋白的自噬受体参与铁死亡的发生［16］，铁离子的积累和耗竭可以调节RNA结合蛋白PCBP1的稳定性，并进一步影响T细胞（包括CSF2和ІL-2）中促炎性细胞因子的表达［17］。BPDE暴露会导致NCOA4的表达改变，进而通过自噬引发细胞铁死亡，因此铁死亡也被认为是一种自噬依赖性细胞死亡方式［18］。

综上所述，BPDE短期暴露主要引起以IL-17信号通路为主的炎症反应和以铁死亡为特征的肺细胞损伤，可能与BPDE暴露引起的肺损伤有关。本次采用细胞模型探讨了BaP代谢产物BPDE短期暴露对基因表达的影响，相关机制还需要在动物实验和暴露人群中进一步验证。