改良QuEChERS方法结合气相色谱测定红甜菜中20种农药残留

刘 琳，马腾飞，贾孙悦，周 芹,3,4，王皙玮,3,4

（1黑龙江大学现代农业与生态环境学院，哈尔滨 150080；2黑龙江大学化学化工与材料学院，哈尔滨 150080；3农业农村部甜菜品质监督检验测试中心，哈尔滨 150080；4农业农村部糖料产品质量安全风险评估实验室，哈尔滨 150080）

0 引言

红甜菜是甜菜的一个变种，又称为食用甜菜、紫菜头、牛皮菜等。它具有良好的营养价值，其根和叶都可食用，根可经煮沸、烧烤、腌制后做汤、果酱、果汁、拌沙拉等，叶可作为食品以及菠菜熟食的替代品[1]。据研究表明[2-3]，红甜菜还具有良好的抗氧化能力，花青素的存在能有效清除人体内的自由基，增强人体的免疫力和抗癌作用，因此食用甜菜在未来医学保健方面具有潜在的应用价值。目前，人们对于蔬菜及食品中的农药残留限量检测越来越关注[4]，联合国粮农组织和世界卫生组织及有些国家都制定了相关的不同农药在不同作物上的农药残留的最大检出限量（MRL）[5]规定，但是国内外对于红甜菜，甚至甜菜方面的农药残留检测技术研究都较少[6]，多残留检测更是鲜有报道，因此建立一种简单、快速、准确的农药多残留联合检测技术势在必行。农药多残留检测最常用的仪器方法主要有气相色谱法（GC）[7-8]、液相色谱法（LC）[9]、气相色谱-质谱联用的方法（GC-MS）[10-12]、液相色谱-质谱联用的方法（LC-MS）[13-14]。其中色谱法主要是针对某一类农药残留进行检测，如GC-ECD（电子捕获检测器）[15-16]适用于有机氯及拟除虫菊酯类农药检测，GC-FPD（火焰光度检测器）[17]适用于有机磷农药的检测。电子捕获检测器具有灵敏度高、检出限低的特点，广泛应用于含有较强的电负性元素的一类物质，如F、Cl、O等。有机氯及拟除虫菊酯类农药分别含有氯元素和氧元素，可以使用电子捕获检测器进行检测。

前处理是农药残留检测重要环节，目前的方法主要包括固相萃取（SPE）[18-19]法 、分散固相萃取（d-SPE）[20-21]法 、超临 界 了 流 体 萃 取（SFE）[22-23]法 等 。QuEChERS法（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）于2003年由Anastassiades等提出[24-25]，是基于分散固相萃取法建立起来的一种快速样品前处理技术，广泛应用于动植物源食品农药残留、兽药残留的检测中。随着前处理技术的不断提升，许多研究者对传统QuEChERS方法进行了改进，大大提升了前处理净化复杂基质的效果。碳纳米管（Carbon nanotubes,CNTs）是碳六元环构成的类石墨平面卷曲而成的纳米级中空管，与GCB、PSA和C18相比具有更大的比表面积、吸附容量和吸附能力，能够在较短的平衡时间内实现萃取分离[26-27]。多壁碳纳米管（Multiwalled carbon nanotubes,MWCNTs）与单壁碳纳米管 （Single walled carbon nanotubes,SWCNTs）相比，吸附性更强，目前已在水样、农药残留、兽医检测多有应用[28-31]，但在甜菜农药残留检测中少有报道。由于红甜菜基质复杂，前处理净化尤为重要，本研究采用改良的QuEChERS方法，简化了前处理步骤，以多壁碳纳米管作为吸附剂，结合GC-ECD（电子捕获检测器）建立20种有机氯、拟除虫菊酯农药在红甜菜中的检测方法。该方法操作简单、快速、准确、成本低，能满足红甜菜中一些高毒、难降解农药的检测要求，适合在小型实验室和企业中推广使用，对于保证红甜菜品质具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪器：岛津气相色谱仪（GC-2010）带有电子捕获检测器，RTX-1气相色谱柱；旋转蒸发仪RE300；匀浆机（LB20ES美国Waring公司）；KQ-250DB型数控超声波清洗器；

试剂：正己烷为色谱纯，乙腈、丙酮、NaCl均为分析纯，购于天津市光复科技发展有限公司；MWCNTs（直径大于50 nm，长度为9.089µm，纯度为98%，比表面积为244 m2/g），由山东大岛纳米材料有限公司提供；Cleanert Florisil固相萃取柱；QuEChERS净化管（900 mg MgSO4/150 mg PSA）；异狄氏剂、莠去津、溴氰菊酯、顺式二氯苯醚菊酯、γ-六六六、氰戊菊酯、pp'-滴滴滴、pp'-滴滴伊、pp'-滴滴涕、op'-滴滴涕、氯氟氰菊酯、甲氰菊酯、氟氯氰菊酯、δ-六六六、百菌清、β-六六六、艾氏剂、α-六六六、七氯、二氯苯醚菊酯农药标准溶液均为1000 mg/L，购于农业农村部环境质量监督检验测试中心（天津）。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液的配置 取适量标准物质，用丙酮稀释成100 mg/L的标准储备液。从20种标准储备液中各取0.1 mL于10 mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，得到1 mg/L的标准混合溶液，置于4℃的冰箱中保存。1.2.2提取 取适量红甜菜，切碎后准确称取25 g于烧杯中，然后加入50 mL的乙腈，置于匀浆机中匀浆3 min，再转入事先装有5 g NaCl的具塞量筒中剧烈震荡，室温下静置30 min以上，待有机相与水相分层，取10 mL上清液于75℃旋转蒸发仪浓缩至尽干，加入5 mL正己烷溶解，待净化。

1.2.3 净化 取3 mL上述提取液于小烧杯中，加入10 mg多壁碳纳米管，震动摇匀，用一次性针管取1.5 mL溶液，过0.22µm有机滤膜后供气相色谱（GC-2010）测定。

1.2.4 气相色谱条件 进样口温度：220℃；柱箱采用程序升温：初始150℃，保持2 min，6℃/min升到177.6℃，1℃/min升到 178℃，最后 6℃/min升到 250℃，保留15 min，共34 min；检测器（ECD）温度：300℃；载气：氮气，流速4 mL/min；进样量为5µL。

2 结果与分析

2.1 仪器条件的确定

将20种农药混和标准溶液进样，仪器条件为柱箱初始温度150℃，保留2 min，6℃/min升温到270℃，保留23 min，在此仪器条件下，发现γ-六六六与δ-六六六保留时间过近导致不易分离，后通过不断地调整程序升温条件，在γ-六六六开始出峰时，以1℃/min的速率进行升温，时间为0.4 min，最终各种成分达到有效分离。由于达到270℃时导致保留时间靠后的农药出峰不稳，易受杂质影响，所以把程序升温的最终温度降到了250℃，效果明显提升。图1为在上述气相色谱条件下20种有机氯、拟除虫菊酯类农药混合标准溶液的色谱图，目标化合物都得到很好的分离。

图1 20种有机氯、拟除虫菊酯类农药的混合标准溶液的色谱图

2.2 前处理条件的优化

2.2.1 提取溶剂的选择 农药残留检测常用的提取溶剂有乙腈、甲醇、乙酸乙酯、正己烷等，不同溶剂对农药残留的提取效率有所不同。本研究采用加标回收的方法对比了上述几种溶剂的提取效果，净化采用1.2.3步骤方法，得到了不同提取剂与目标化合物的回收率关系图（图2）。结果表明，乙腈对这20种化合物的提取能力最佳。一般来说，极性较小的农药可以使用石油醚、正己烷等非极性溶剂或与极性溶剂混合的溶剂提取；极性较强的农药可以用极性溶剂或含水极性溶剂，如丙酮、甲醇等；含水量较多的植物样品可以用与水能相混溶的极性溶剂，如丙酮、乙腈。红甜菜含糖较低，水分含量较高，所以本实验则选取乙腈作为提取溶剂。

图2 不同提取剂对回收率的影响

2.2.2 净化方法的选择 红甜菜含有大量的色素，会对农药残留测定造成一定干扰，进样前需要对样品进行净化。样品净化方法包括固相萃取法、固相微萃取法、膜分离法等等，在诸多的净化方法中，固相萃取法在农药残留分析中广泛应用。本实验对比了常规的固相萃取和分散固相萃取2种净化方式对于样品的净化效果，参照NY/T 761—2008标准的净化部分，常规的固相萃取使用Cleanert Florisil固相萃取柱，QuEChERS净化管（900 mg MgSO4/150 mg PSA）和MWCNTs作分散固相萃取实验。比较了3种净化方式对于农残回收率的影响。

Cleanert Florisil固相萃取柱含有二氧化硅（84%）、氧化镁（15.5%）和硫酸钠（0.5%）等组成成分[32-33]，经样品溶液分离、洗脱后能去除色素、烃类含氮化合物及抗生素等物质。QuEChERS净化管由无水MgSO4与PSA组合，可以有效去除提取溶液中的水分以及色素等杂质。多壁碳纳米管内径十分小却有极高的强度，对目标有机化合物有极好的吸附能力，少量的吸附剂便可在短时间内达到有效净化分离。

结果显示（图3），固相萃取柱对杂质和农药吸附能力都很强，导致加标回收率偏低，而多壁碳纳米管在3种吸附剂中整体所获回收率最高，由色谱图（图4）可以看出，采用多壁碳纳米管后干扰杂质就相对更少了，具有较好的回收净化效果。因此，试验选用多壁碳纳米管作为前处理的净化吸附剂。

图3 不同净化剂对农药加标回收率的影响

图4 未净化空白样品加标农药色谱图（A）和经多壁碳纳米管吸附后的空白样品加标农药色谱图（B）

2.2.3 MWCNTs用量的确定 比较不同MWCNTs的用量（5、10、25、40 mg）对各农药加标净化效果及回收率的影响。结果表明（图5），随着用量的增加，溶液MWCNTs颜色逐渐加深，进样瓶溶液更为清澈。但是当MWCNTs用量大于10 mg时，20种农药的回收率逐渐降低，因此10 mg用量时得到的农药回收率最高、净化效果最好，本试验则选取10 mg为MWCNTs用量。

图5 MWCNTs的用量对农药加标的回收率的影响

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系与检出限 在最优条件下，对混合标准工作溶液进行检测，以各农药的质量浓度为横坐标（X，mg/L），对应峰面积为纵坐标（Y），采用外标法绘制标准曲线，得到线性回归方程及相关系数。以3倍信噪比（S/N=3）对应的浓度定义为检出限（Limit of detection,LOD），10倍的信噪比（S/N=10）对应的浓度定义为定量限（Limit of quantitation,LOQ）。结果显示（表1），20种农药在 0.01～0.50 mg/L（莠去津为0.03～0.50 mg/L）范围内线性关系良好，相关系数（R2）均大于0.99，LOD为0.12µg/L～0.063 mg/L，LOQ为0.4µg/L～0.21 mg/L。

表1 20种农药的保留时间、线性关系、检出限及定量限

2.3.2 回收率与精密度 在最优试验条件下，对20种农药在红甜菜空白样品中的加标回收率进行考察。在低、中、高3个加标水平下，重复测定6次，20种农药的平均回收率在62.0%～116.5%之间，相对标准偏差（RSD，n=6）为1.9%～10.9%（表2），加标回收率和精密度均满足农药残留分析相关要求。

表2 20种农药在红甜菜中的加标回收率和相对标准偏差（n=6）

3 结论与讨论

本研究采用改良的QuEChERS法，建立了红甜菜中20种农药残留的联合测定方法。样品采用改良的QuEChERS法进行净化及提取，气相色谱-ECD进行检测，20种农药的检出限及定量限均符合要求。

使用常见有机溶剂（乙腈、甲醇、乙酸乙酯、正己烷）进行了提取比较试验，根据20种农药的加标回收率情况，选择了样品加标回收率最佳的乙腈作为提取溶剂。由于气相色谱-电子捕获检测器的检测限较低、灵敏度较高，容易出现目标峰外的干扰杂质，因此对于实验前处理条件要求较高。QuEChERS法在许多研究中都有成功案例[34-35]，本试验在QuEChERS法原理的基础上进行改良，选取Cleanert Florisil固相萃取柱、QuEChERS 净化管（900 mg MgSO4/150 mg PSA）和MWCNTs 3种净化方法进行对比试验，发现MWCNTs具有较强的吸附、净化能力，并在20种有机氯、拟除虫菊酯农药残留的空白加标样品中都能够得到较高的回收率，所以最终选择多壁碳纳米管作为QuEChERS法的吸附剂。试验简化了前处理净化步骤并结合多壁碳纳米管作为吸附剂，得到了改进的QuEChERS分析方法，较传统方法而言具有简单、快捷、灵敏、准确等优点。

根据GB 2763—2019《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》[36]的相关规定标准，研究建立了气相色谱-电子捕获检测器同时测定红甜菜中20种有机氯、拟除虫菊酯农药残留的方法，对仪器参数和样品前处理都进行了一定的优化。本检测方法对红甜菜样品进行了低、中、高3个水平浓度的农药添加，所测的目标化合物在0.01～0.50 mg/L（莠去津为0.03～0.50 mg/L）范围内呈现了良好的线性关系，相关系数（R2）均大于0.99，平均回收率在62.0%～116.5%之间，相对标准偏差（n=6）在1.9%～10.9%之间。该方法充分满足了红甜菜中有机氯及拟除虫菊酯类多农药残留测定的要求，具有简单、灵敏度高、重复性好等优点，可大力推广于中、小型实验室中。