活性氧技术对修复土壤连作障碍及提高番茄品质的影响

王晓云，蔡云彤，吴洪生，张绪美，徐金益，马文舟，张金福，胡青青，孙 倩，张 倩，丁 军，沈文忠

（1兴化市农业技术推广中心，江苏兴化 225500；2南京信息工程大学，南京 210044；3太仓市农业技术推广中心，江苏太仓 215400；4无锡市农业技术推广总站，江苏无锡 214021；5盱眙县耕地质量保护站，江苏盱眙 211700；6南京市高淳区耕地质量保护站，江苏高淳 211300）

0 引言

设施农业是利用必要的设施和设备创造相对可控的环境条件，采用人为介入方式改变农作物生长条件，使其在一定程度上摆脱季节、气候等因素的限制，减少自然灾害带来的不良影响，提高农产品产量和品质，满足周年供应，实现高效、集约化、可持续的现代农业生产方式[1]。设施栽培在中国已经十分普及，全种植面积居世界第一。随着栽培年限的延长，普遍出现了土壤质量退化、土传病害发生严重等连作障碍问题，据统计，5年以上的大棚出现连作障碍的高达80%以上，连作20年以上的几乎达100%，土壤酸化、次生盐渍化、养分失衡、化感物质/自毒物质胁迫、微生物区系改变、土传病害增加、土壤酶活性降低、植物抗性下降等是设施栽培土壤连作障碍的常见的几种障碍因子[1-2]，已成为设施茄果类蔬菜生产可持续发展的瓶颈[2-3]。

随着农业产业结构的不断调整，中国设施栽培面积逐年扩大，由于设施栽培集约化、复种指数高和种类单一等特点，连作障碍现象愈加突出，严重制约了设施农业生产的可持续发展[4]。

番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）是世界第一大蔬菜作物，在蔬菜和水果中居于首位，因营养丰富而被广泛种植。由于产业结构的调整，设施番茄的种植面积逐渐扩大，番茄土传病害的发生与危害亦呈逐年加重的趋势[5]。

设施栽培番茄2～10年后，土壤细菌真菌的数量及含盐量增加，土壤酶活性先增加后下降[6]。番茄土传病害危害严重的主要是枯萎病（萎蔫病）和青枯病，可造成被侵染番茄烂根死苗，发病严重田块的发病率高达80%以上[7]。

目前常用防控设施栽培土壤连作障碍技术包括：选用抗病良种[8]、清洁田园[9]、轮作间作套种[9]、嫁接苗[10]、棉农土壤消毒技术[10]、溴甲烷土壤消毒剂[11]、石灰氮土壤消毒技术[10]、太阳能高温焖棚、水旱轮作[9]、拮抗菌剂[7]、有机肥[12]、有机物料[13]、生物有机肥、复合微生物菌剂[14]、平衡施肥、科学灌溉、土壤改良剂[8,11]、土壤电化学消毒等[1]。但是，这些方法各有优缺点，不能取得很好的综合效果。

本研究介绍活性氧高温淹水焖棚技术对于设施栽培番茄土壤连作障碍的防控及其对番茄产品和品质的影响进行研究，以期寻找一种可行的高效绿色生态防控技术，促进番茄可持续生产。

1 材料与方法

1.1 土壤理化性状测定

土壤有机质测定：重铬酸钾外加热法测定[15]，土壤全氮测定：凯氏定氮法[15]，土壤碱解氮测定：康惠皿法测定[15]，土壤速效磷测定：0.05 mol/L HCl-0.025 mol/L H2SO4[15]，土壤速效钾测定：NH4AOc浸提，原子吸收分光光度法测定[15]，土壤容重测定：环刀法进行[16]，土壤含盐量测定：电导法[15]，土壤pH测定：pH计。试验在南京六合农民大棚进行。

1.2 土壤微生物测定

土壤尖孢镰刀菌番茄转化型（Fusarium oxysporumf.sp.lycopersici）（简写成FOL）和青枯病菌[Ralstonia solanacearum（Smith）Yabuuchi et al.]（简写成RS），采用荧光定量PCR测定。在试验开始前和处理结束后分别采集土样，用土壤DNA试剂盒（Fast DNA extraction for soil kit，MP公司）提取土壤总DNA，根据试剂盒说明书进行提取纯化后，电泳、PCR检测DNA，然后进行荧光定量PCR检测土壤中的枯萎病菌和青枯病菌的数量。

尖孢镰刀菌西瓜专化型荧光定量PCR采用[17]特异性 的 引 物 OFl/FORl，ACATACCACTTGTTGCCTCG/CGCCAATCAATTTGAGGAACG对土壤中待测菌株病原菌尖孢镰刀菌番茄专化型进行荧光定量PCR扩增。番茄青枯病菌荧光定量PCR引物采用[18]特异性引物759/760，GTCGCCGTCAACTCACTTTCC/GTCGCCGTC AGCAATGCGGAATCG进行。荧光定量PCR引物送南京金斯瑞生物科技有限公司合成。尖孢镰刀菌番茄专化型实时荧光定量PCR（qPCR）采用反应体系：SubgreenI Mix 15 μL，正向引物2 μL，反向引物12 μL，模板DNA 2 μL，SYBR© Premix Ex TaqTM2 μL，ddH2O 27 μL，升温程序为：预解链94℃60 s，解链温度94℃ 60 s，退火温度 58℃ 30 s，延伸温度 72℃ 60 s，35 个循环；72℃7 min，4℃保存。番茄青枯病菌实施荧光定量PCR采用反应体系（潘哲超等）PCR反应体系组分（25 μL）包含 1.5 mmol/L MgCl2，250 μmol/L dNTPs，50 mmol/L KCl，10 mmol/L Tris-HCl及 1.25 U TaqDNA聚合酶，SYBR© Premix Ex TaqTM2 μL，正反向引物各4 pmol，50 ng模板DNA。PCR反应程序：96℃预变性9 min；95℃变性1 min，64℃复性1 min，72℃延伸2 min，30个循环：最后72℃延伸10 min，4℃保存。

首先建立荧光定量PCR的标准曲线。采用本实验室保存的番茄尖孢镰刀菌和青枯病菌进行。首先进行目标基因片段PCR扩增，将上述提取的土壤总DNA分别进行PCR扩增，PCR反应体系及条件同上。扩增产物在电泳槽80 V，30 min电泳后，紫外凝胶成像后切胶，使用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒（杭州昊鑫生物科技股份有限公司）回收目的基因片段，根据试剂盒厂家说明书要求进行操作。然后采用使用trangen公司的pEASY-T3 cloning kit试剂盒合成质粒，按照说明书操作进行，吸取5µL菌液、25µL ddH2O到200µL反应管中，沸水浴30 min后进行PCR，跑胶后通过凝胶成像初步验证是否酶连成功，进行质粒的初步验证。试验中采用LB培养基进行大肠杆菌的培养，所有LB培养基：胰蛋白胨10 g；酵母提取物5 g；NaCl 10 g；琼脂16 g；pH 7.0；加水至1 L（注：液体培养基配方中不加琼脂）。然后使用Axygen公司的小量质粒抽提试剂盒提取质粒，使用核酸定量仪（Nanodrop）测定质粒中的DNA浓度，并通过OD260/OD280、OD260/OD230判断DNA的纯度，进行荧光定量PCR，每一样品测定3次，取平均值，每次样品测定前需吸取1µL ddH2O进行空白测定，消除样品间的相互影响。由公式（1）～（2）计算质粒拷贝数，将其稀释到107/µL、106/µL、105/µL、104/µL、103/µL，用于绘制标准曲线。计算公式如式（1）～（2）所示。

样品实施荧光定量PCR采用Roche公司的LightCycler® 96进行，使用Takara公司的SYBR©Premix Ex TaqTM，通过SYBR Green法测定室内试验土壤样品中硝化细菌与反硝化细菌的基因拷贝数。反应体系为DNA1µL、正向引物0.5µL，反向引物0.5µL，Taq酶10µL，ddH2O 8µL，引物序列见上述介绍。反应在LightCycler®96仪器配套的96孔板中进行，每个样品设置3个重复，并以ddH2O做阴性对照。qPCR反应体系需设置熔解曲线，利用不同PCR产物的Tm值不同对PCR的特异性进行鉴定。如果熔解曲线为单峰，那么是目标产物发出的荧光，试验有效，若为双峰，则说明出现了非特异性扩增，试验结果无效，需调整qPCR的反应程序。使用已知拷贝数的质粒绘制标准曲线，当数据间的相关系数大于0.999时，质粒可以正常使用。

1.3 番茄品质测定

番茄果实维生素C测定：2,4-二硝基苯肼[15]，番茄果实膳食纤维测定：酸性洗涤法[15]，番茄果实可溶性糖测定：pH计，番茄果实可溶性总糖测定：酸水解铜还原直接滴定法[15]，番茄果实硝酸根测定：水杨酸比色法[19]。

1.4 试验设计

试验前大棚连续种植番茄4年，试验前采集土样分析测定有关指标，基础性状见表1。

表1 试验大棚土壤基本理化及生物性状

试验设处理：（1）对照（CK），不处理；（2）活性氧处理（AO）；（3）活性氧处理+高温淹水焖棚（AO+SF），每个处理3次重复，每个小区面积30 m2，随机排列。试验在大棚内进行，利用夏季休闲空隙，7月10日开始进行处理，持续一个月，到8月10日处理结束，每公顷施用鸡粪有机肥（N 2.7%，P2O50.9%，K2O 1.7%）15000 kg，第一次开花结果后用复合肥（15-15-15）225 kg追肥，采摘第一次果实后再次复合肥追肥每公顷150 kg，第二次采摘果实后再次复合肥追肥10 kg。试验前每个小区采集20 cm表层500 g土样进行理化性质分析和生物性状分析。活性氧采用南京怡可帮生态环境科技有限公司发明专利生产的连作障碍治疗仪进行。开动治疗仪，出水中含有臭氧等活性氧，对试验小区灌溉，四周筑埂20cm高，小区之间通过挖沟深40 cm、宽50 cm相互隔离，使得活性氧水积水5 cm深，3天后再次灌溉活性氧水，处理3在此基础上，第二次灌溉活性氧水后，立即用塑料膜覆盖，四周密封，太阳光自然暴晒，所有处理一个月后，揭开塑料膜，采集20 cm表层土样，进行分析，比较处理前后土壤理化性状和生物性状的变化。

各小区管理措施相同，2017年8月11日每公顷15000 kg鸡粪有机肥，均匀撒到土壤表面，然后用小拖拉机耕翻，再用旋耕机旋耕2次，把鸡粪与土壤混匀，每个小区单独施肥、耕翻，小区之间开沟，8月20日移栽2片真叶番茄苗，行株距30 cm×40 cm，10月18日开始开花，10月28日开始结果，11月25日进入盛果期，12月8日第一次采摘番茄，随后每公顷施用复混肥（15-15-15）225 kg，灌水一次，12月25日第二次采摘番茄，随后第二次施用复合肥225 kg，1月13日第3次采摘番茄，随后第3次施用复合肥150 kg，1月28日第4次采摘番茄，随后第四次施用复合肥150 kg，2月20日第5次采摘番茄，试验结束。

1.5 供试番茄种子

‘粉妃’番茄，购自南京市浦口区盘城华为农资公司。

1.6 供试有机肥和复合肥

购自南京市浦口区盘城华为农资公司5%商品有机肥；复合肥为45%（15-15-15）。

1.7 供试活性氧水机

活性氧采用连作障碍治疗仪进行，该仪器为南京怡可帮生态环境科技有限公司发明专利制造。

1.8 数据处理剂统计

数据采用Microsoft Office Excel进行处理，采用SPSS19进行统计，处理间差异采用LSD法进行多重比较，95%置信区间进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 对土壤尖孢镰刀菌番茄专化型和番茄青枯病菌的影响

经过活性氧及高温淹水焖棚后，设施栽培番茄连作障碍土壤中番茄枯萎病菌尖孢镰刀菌番茄专化型数量发生了显著变化。经过荧光定量PCR检测到的土壤活性氧处理比对照下降79.2%，活性氧加高温淹水焖棚处理比对照下降93.5%（图1a）。表明活性氧能够大幅杀灭连作土壤中的尖孢镰刀菌，配合高温淹水焖棚足以杀灭绝大部分土壤尖孢镰刀菌，减少设施栽培土壤连作土传病害的发生。活性氧及高温淹水焖棚也显著的杀灭土壤青枯病菌，与未经处理的对照土壤相比，活性氧处理土壤中青枯病菌下降83.3%，活性氧加高温淹水焖棚处理下降91.7%（图1b），说明活性氧能够有效的杀灭连作障碍土壤中的青枯病菌，如果配合高温淹水焖棚则效果更好。

图1 不同处理对土壤尖孢镰刀菌番茄专化型和青枯病菌的影响

2.2 对土壤理化性状的影响

活性氧及高温淹水焖棚处理，显著改变了设施栽培连作番茄土壤的理化性状。经过处理后，活性氧处理土壤电导率比对照下降55.5%（图2a），容重下降4.43%（图2b），活性氧加高温淹水焖棚效果更好，下降幅度更大，但是土壤有机质含量变化不大（图2c）。实际是活性氧水喝高温淹水焖棚时的过量的水分将连作障碍土表的可溶性盐分溶解淋洗到地下水去，从而减少土表可溶性盐分的积累。

图2 不同处理对土壤理化性状的影响

2.3 对番茄产量影响

活性氧处理设施栽培连作障碍土壤后，种植番茄，对番茄生长有很好的促进作用。与对照相比，活性氧处理番茄产量增加20.2%，活性氧加高温淹水焖棚处理番茄产量增加23.7%（图3），活性氧加高温淹水焖棚产量高，但是差异不显著，这跟活性氧及高温淹水焖棚部分消除了土壤连作障碍因子有关。

图3 不同处理对番茄产量的影响

2.4 对番茄果实Vc影响

活性氧和高温淹水焖棚处理设施栽培连作障碍土壤后，番茄果实的Vc含量提高。与对照相比，活性氧处理增加52.9%，活性氧加高温淹水焖棚增加76.2%（图4），这可能是活性氧+高温淹水焖棚杀灭了土壤病原菌，促进番茄生长，从而提高番茄果实内的维生素。

图4 不同处理对番茄果实Vc影响

2.5 对番茄果实膳食纤维影响

膳食纤维对人体有重要作用，活性氧和高温淹水处理后，连作障碍土壤中的理化性状和生物学性状发生改变，导致番茄生长变化，增加番茄中的膳食纤维含量，与对照相比，活性氧处理增加20.9%，活性氧加高温焖棚处理增加23.3%（图5），这有助于提高番茄的食用价值和品质。

图5 不同处理对番茄果实膳食纤维影响

2.6 对番茄果实酸度影响

活性氧和高温淹水焖棚处理促进番茄果实有机酸的合成和积累，与对照相比，活性氧处理总酸度提高34.4%，活性氧加高温淹水焖棚处理增加43.4%（图6），说明活性氧及高温淹水焖棚处理后，改变了土壤的理化性状和生物性状，促进番茄生长，提高番茄果实有机酸的合成和积累。

图6 不同处理对番茄果实酸度影响

2.7 对番茄果实可溶性还原总糖影响

经过活性氧和高温淹水焖棚处理连作障碍土壤后，番茄果实的还原性可溶性总糖显著提高，跟对照相比，活性氧处理增加12.8%，活性氧加高温淹水焖棚处理增加16.8%，表明活性氧处理设施栽培连作障碍土壤后，促进番茄生长，促进番茄果实中可溶性糖的积累（图7）。

图7 不同处理对番茄果实可溶性总糖影响

2.8 对番茄果实硝酸根含量影响

活性氧和高温淹水焖棚处理设施栽培连作障碍土壤后，种植的番茄果实中硝酸根含量有所下降。与对照相比，活性氧处理的番茄果实中硝酸根含量下降16.3%，活性氧加高温焖棚下降14.2%，说明活性氧处理设施栽培连作障碍土壤，不仅杀灭土传病害，而且能够减少硝酸根在番茄果实里的积累（图8）。

图8 不同处理对番茄果实硝酸根含量影响

3 结论

（1）活性氧可以有效控制和修复设施栽培连作障碍土壤；

（2）活性氧加高温淹水焖棚技术可以抑制土壤病原菌；

（3）活性氧加高温淹水焖棚技术可以降低土壤表层可溶性盐分和容重；

（4）经过活性氧加高温淹水焖棚修复后的土壤种植的番茄产量提高品质改善。

4 讨论

4.1 活性氧对设施栽培连作障碍土壤理化性状影响

多年连作导致设施大棚内土传病虫害大量积累，极易引起大暴发、大流行，造成减产甚至绝收[3]。由于大棚设施常年覆盖或季节性覆盖，棚内土壤得不到雨水的淋洗调节，棚室内温度较高，水分蒸发比露地强烈，水分蒸发量大，养分、盐分在土壤表层聚集，形成白色的盐层，即土壤次生盐渍化。长期过量施肥，加速了土壤发生酸化，出现化学逆境[3,20]。

本研究中，连作5年的番茄大棚，土壤连作障碍严重，经过活性氧处理，土壤连作障碍因子得到控制，促进番茄生长。土壤表层聚集的可溶性盐分由于活性氧水的溶解淋洗到地下水而大幅下降[21-22]，与对照相比下降55.5%，采用活性氧加高温淹水焖棚效果更好，从而修复土壤物理环境。控制盐分积累是防止或减轻设施栽培中土壤次生盐渍化的最根本措施[20]。土壤表层集聚的可溶性盐分淋洗到土壤深层地下水中，孔隙度加大，导致土壤容重下降[23]。

4.2 活性氧对设施栽培连作障碍土壤病原菌的影响

设施栽培连作障碍土壤中微生物区系发生显著改变，尤其是病原真菌大幅增加[6]。番茄土传病害危害严重的主要是枯萎病（萎蔫病）和青枯病，可造成番茄烂根死苗，严重田块发病率高达80%以上[7]。

目前生产上采样拮抗菌和生防菌[7,24-25]、高温淹水焖棚[23]、化学药物[26]、栽培基质[8,27]、全有机营养[28]、不同有机物料[13,29-30]、有机肥[12,31-32]、臭氧[33]等防控设施连作障碍土传病菌，有各自的优缺点。

本研究中，采用活性氧水技术防治土壤中的枯萎病菌和青枯病菌，土壤活性氧处理比对照下降79.2%，活性氧加高温淹水焖棚处理比对照下降93.5%（图1a），表明活性氧加高温淹水焖棚能够用于修复设施栽培土壤连作障碍。

4.3 活性氧对番茄生长及品质影响

活性氧处理连作障碍土壤后，增加番茄产量，降低番茄果实中的硝酸根，提高番茄果实品质。与对照种植的番茄相比，活性氧处理的番茄产量增加20.2%，番茄果实的Vc含量增加52.9%，番茄中的膳食纤维含量，增加20.9%，总酸度提高34.4%，番茄果实的还原性可溶性总糖增加12.8%。蔬菜中的硝酸盐含量与氮素化肥的施用量呈正相关，过量施用氮肥导致蔬菜硝酸盐累积，影响人体健康[34]，活性氧处理的番茄果实中硝酸根含量下降16.3%，进一步提高番茄的营养价值和品质，保障食品安全。