褪黑素对低温胁迫下棉花种子萌发特性的影响

娄 慧，赵曾强，朱金成，张 薇

（1石河子大学农学院，新疆石河子 832000；2新疆农垦科学院生物技术研究所，新疆石河子 832000）

0 引言

棉花是世界上重要的经济作物，在中国经济发展中占据着重要地位。新疆由于光热资源丰富，已成为中国最大的棉花种植区。棉花是喜温作物，新疆4—5月是棉花播种期，由于独特的地理条件，经常会发生低温和冷害情况，影响种子的萌发及生长发育[1]。作物生长发育包含着多种环节，种子萌发是作物生长全过程最为重要的环节，许多生理和生化反应均发生于种子吸胀之后，以便为幼苗的后期生长提供了充足养分储备，并且种子萌发还决定了作物后期的生长状况，最终影响了作物的产量以及经济效益[2]。当作物在萌发初期受到低温冷害，植物体细胞内活性氧平衡会被打乱，将导致种子不能够正常地发芽出苗，降低种子的萌发指数[3]。过低的温度将会使植物体内的正常代谢系统紊乱，使作物不能顺利进入萌发阶段，细胞膜上的膜系统无法正常发挥其功能，导致活性氧自由基的数量大幅减少，植物体内抗氧化酶系统中的SOD、POD、CAT的活性快速下降，MDA和H2O2的含量有所增加[4]。在低于植株萌发所需的正常温度时，植物通过增加渗透调节来减少低温胁迫造成的伤害，从而为新陈代谢的发育提供必要的营养。因此，研究棉花种子在低温胁迫下的萌发特性及调控作用具有重要意义。褪黑素（Melatonin）是一种外源激素，适量施用有利于作物生长发育[5-7]。褪黑素的预处理可改善低温胁迫下玉米种子的萌发特性，并进一步提高其抗逆性[8]。研究表明，褪黑激素可以增强种子抵抗不良环境的生存能力。当喷施一定浓度的褪黑素于大豆的叶片，发现大豆的长势相比较于对照组，有着很明显的改善，主要表现在植株叶片数目和每荚豆粒数目的增加[9]。在低于菘蓝种子正常生长的温度条件下，对其施加一定浓度的褪黑素，可减少膜脂过氧化所带来的损伤，有利于植物生长发育[10]。通过试验证明，在化学物质的胁迫下，黑麦草种子浸泡于褪黑素中一段时间，其萌发指标均有所改善，生长发育状况得到了改善，干鲜重有所增加[11]。同时，已经证实，在低温的生长环境下，通过使用外源褪黑素可以帮助水稻种子进行正常的生长发育，以便顺利进行到萌发阶段，可提高水稻的萌发指数。在盐胁迫下，水稻种子细胞内将会发生剧烈的化学反应，会产生许多有毒物质，而不利于作物生长，导致植物体细胞中一系列的抗氧化酶活性显著降低，外源施加65 μmol/L褪黑素可减轻对抗氧化酶的抑制作用[12-13]。近年来，国内外众多学者研究了低温胁迫对棉花种子萌发特性的影响。但关于外源褪黑素对棉花种子萌发性状的调节作用报道较少。本研究以海岛棉品种“新海41号”为材料，探求低温环境下棉花种子萌发特性、抗氧化酶活性影响。明确在低温胁迫条件下，不同浓度褪黑素对棉花种子萌发的调控作用，为利用褪黑素提高棉花种子耐冷性提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

材料为海岛棉品种‘新海41号’，由石河子大学农学院棉花分子育种实验室提供。

褪黑素购于Sigma-Aldrich公司。丙二醛（MDA）、超氧化歧化酶（SOD）、过氧化氢（H2O2）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）检测试剂盒购于苏州科铭生物公司，其他化学试剂均为国产分析纯。试验在石河子大学北苑新区农科楼实验室，于2020年2月—5月进行。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 选取大小相同，籽粒饱满的棉花种子，用NaClO3充分浸泡1 min，用75%乙醇浸泡3 min，蒸馏水冲洗4次。将消毒后的棉花种子，晾干于超净工作台上，恢复至种皮表面无水分，用不同浓度褪黑素浸种24 h后，将种子放在带有2层发芽纸的发芽盒中，在光照培养箱进行种子萌发实验（相对湿度设定为50%、16 h光照/8 h黑暗、光照强度为284 µmol/（m2·s）。对于不同的处理，进行3次重复，选取棉花种子50粒，在培养箱中低温15℃下分别用浓度为0（CK2）、10（MT10）、20（MT20）、50（MT50）、100（MT100）μmol/L的褪黑素浸种发芽7天，以常温25℃下用蒸馏水处理为对照（CK1），胚芽长度大于棉花种子长度的1/2视为发芽。

1.2.2 萌发指标测定 棉花种子萌发的周期为7天，以放人培养箱当天为标准，每天于早上10:00，记录种子相关萌发数据。

其中，Gt是对应天数发芽率，Dt是相对发芽天数。

1.2.3 胚根长度测定 当棉花种子萌发7天时，从各处理中分别取出20粒种子，用游标卡尺进行胚根长度的测量，每个处理重复3次。

1.2.4 抗氧化酶活性的测定 取对照及褪黑素处理后3、6、12、24、48 h的棉籽，每份3～5 g，去除种皮后液氮速冻，保存于-80℃超低温冰箱备用。每处理重复3次。MDA含量测定采用硫代巴比妥酸比色法；SOD活性的检测采用氮蓝四唑光化还原法；POD活性采用愈创木酚法；CAT活性采用紫外分光光度计法；H2O2测定采用紫外分光光度计法。

1.3 数据处理

使用Excel软件处理数据和作图，SPSS软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 褪黑素对低温胁迫下棉花种子萌发的影响

由表1可知，15℃低温处理（CK2）后，其发芽率、发芽势和发芽指数分别为75.26%、72.44%和5.36，与常温对照（CK1）相比均显著降低，分别降低了17.41%、15.73%、74.96%；发芽时间与常温对照相比延长大概5天，说明低温胁迫可显著抑制种子萌发。不同浓度的褪黑素对低温胁迫下棉花种子萌发的影响不同。随着褪黑素浓度增多，MT20处理下种子发芽率最高，为88.59%，比CK2增加了9.11%。但随着褪黑素浓度持续增加，MT50、MT100处理下棉花种子发芽率与CK2差异并不明显，MT100处理下种子发芽率最低，为74.64%，比CK2降低了2.38%。当施加不同浓度褪黑素时，棉花种子发芽势变化趋势与发芽率相似，均呈现出先上升后下降的变化趋势。与CK2相比，MT10、MT20、MT50、MT100，种子发芽势分别增加了3.72%、4.75%、0.09%、-1.09%。平均发芽时间与CK2相比较，MT10、MT20、MT50、MT100 分别缩短了 0.8、1.9、0.1、-0.12天。棉花种子的发芽指数在褪黑素作用下呈现出上升状态，后随着萌发时间的延长有所降低，此变化趋势类似于发芽势和发芽率。上述结果表明MT10和MT20低浓度褪黑素能有效促进种子萌发，MT50和MT100高浓度褪黑素则不利于其萌发。

表1 褪黑素对低温下种子萌发特性的影响处理

由图1可知，15℃低温处理（CK2）后，胚根长度为1.65 cm，与常温对照（CK1）相比均显著降低了40.35%，说明低温胁迫不利于其胚根生长发育。在低温胁迫下，褪黑素处理会影响棉花种子胚根的生长，MT10、MT20和MT50处理下，胚根长度均高于低温对照（CK2）处理，分别为2.33 cm、2.73 cm和1.74 cm，其中MT20处理胚根生长最好，其长度较CK2增加66.06%，而MT100处理下，胚根长度为1.50cm，显著低于低温对照。说明MT10、MT20浓度褪黑素处理具有促进胚根伸长的作用，MT100浓度褪黑素则不利于胚根伸长。

图1 褪黑素处理对低温下胚根长度的影响

2.2 褪黑素对低温胁迫下棉花种子萌发期抗氧化酶活性的影响

酶对作物生长发育非常重要，其中包括很多能够清除活性氧的酶如SOD，POD，CAT等，它们可以减少逆境胁迫引起的氧化损伤[21]。如图2可知，SOD活性在各处理下均表现出相同的变化趋势，呈现出先降低后升高再降低的变化，在种子萌发3 h时，SOD活性最高，12 h时，酶活性降至最低。在15℃低温胁迫下，SOD活性与常温对照（CK1）相比显著增加，在萌发3 h时差异最明显，CK2处理SOD活性为415.36 U/g，比CK1提高了5.52%。随着褪黑素浓度的持续增加，各处理的SOD活性变化趋势并不完全一致，与CK2相比较，MT10、MT20处理SOD活性明显增加，其中MT20处理时，SOD活性在各个时间点均最高，在萌发3h时可达423.16 U/g，比CK2增加了2.65%，MT100处理SOD活性则显著降低。

图2 褪黑素对低温下种子萌发期SOD活性的影响

由图3可知，随着萌发时间的延长，POD活性在各处理下均表现出逐渐下降趋势。在种子萌发3 h时，POD活性最高，48 h时，酶活性降至最低。在15℃低温胁迫下，POD活性与常温对照（CK1）相比显著增加，在萌发24h时差异最为显著，CK2处理POD活性为98g/min，比CK1提高了42.31%。当施用不同浓度褪黑素时，各处理的POD活性变化趋势并不同，与CK2相比较，MT10、MT20处理POD活性显著增加，其中MT20处理时，POD活性在各个时间点均最高，在萌发3 h时可达198.23 g/min，比CK2增加了6.41%，MT50、MT100处理POD活性与CK2差异不显著。

图3 褪黑素对低温下种子萌发期POD活性的影

由图4可知，在48 h萌发时间内，不同处理下CAT活性呈现出先上升后下降，再上升再下降的变化趋势。低温胁迫（CK2）处理的CAT活性显著高于常温对照（CK1），表明低温会降低种子的CAT活性。施加不同浓度褪黑素后，MT10和MT20处理下CAT活性显著高于CK2，其中MT20处理CAT活性最高，在萌发3、6、12、24、48 h，其活性与 CK2 相比分别增加了9.43%、23.33%、9.26%、21.65%和27.66%，MT50处理与CK2相比无显著差异，而MT100处理下CAT活性与CK2相比则显著降低。上述结果表明，低浓度褪黑素处理能有效增强低温胁迫下棉花种子的SOD、POD和CAT活性，其中MT20处理增加最为显著。

图4 褪黑素对低温下种子萌发期CAT活性的影响

2.3 褪黑素对低温胁迫下棉花种子萌发期H2O2和MDA含量的影响

发生逆境胁迫时，植物体内活性氧的代谢将会紊乱，H2O2积累量不断增加[22]。由图5可知，随着萌发时间延长，H2O2含量逐渐降低，但CK2处理中H2O2含量显著高于CK1，表明低温胁迫导致H2O2在棉花种子中不断积累。施加不同浓度褪黑素后，MT10和MT20处理H2O2含量显著低于CK2，其中MT20处理时，H2O2含量在各个时间点降低均最多，在萌发3 h时差异最为明显，比CK2降低了10.81%。MT50和MT100处理H2O2含量与CK2无显著差异，结果表明，MT20处理能显著抑制棉花种子萌发期H2O2的积累。

图5 褪黑素对低温下种子萌发期H2O2含量的影响

导致植物膜脂过氧化伤害的物质有很多，其中MDA是过氧化损伤植物膜脂的主要物质[23]。由图6可知，MDA含量的变化趋势与H2O2相似，并且随着种子萌发时间的延长，其含量逐渐降低。与CK1相比，CK2处理下MDA含量显著增加，在萌发3 h时，MDA含量达到最高0.091 mol/L，比CK1增加了47.17%。施加不同浓度褪黑素后，MT10和MT20处理的MDA含量均显著低于CK2，其中MT20处理时，棉花种子MDA含量分别为0.085、0.072、0.062、0.060、0.059mol/L，与CK2相比分别降低了10.95%、13.93%、17.63%、18.78%、15.14%。随着褪黑素浓度的升高，MT50和MT100处理的MDA含量与CK2相比均有所增加，表明MT20浓度褪黑素可以有效减少膜脂氧化损伤，保持植物体细胞膜的稳定性，高浓度则加重膜脂氧化损伤。

图6 褪黑素对低温下种子萌发期MDA含量的影响

3 讨论

3.1 褪黑素对种子萌发的调节作用

温度低于正常生长温度将会影响棉花种子萌发，这将成为作物生长的主要限制因素。棉花在耐低温方面表现出较其他作物较好的萌发特性。研究表明，在低浓度外源激素和低温条件处理下，棉花根部生长状况较好，并且在同等条件下也有利于地上部生长，有助于棉花植株的出苗，但如果温度过低，则会不利于棉花的生长[14]。褪黑素，也称为褪黑激素，是一种胺类激素，在调节植物抗性和种子萌发中起重要作用。利用施加1 μmol/L外源褪黑激素可以减缓盐胁迫所带来的损伤，可以改善小麦种子发芽的情况，有利于其生长[15-16]。水稻在硝基苯酚胁迫情况下，利用低浓度（10 μmol/L）褪黑素处理可有效促进水稻种子的萌发，减轻对水稻种子的伤害，提高了在低温条件下的生长能力[17]。本试验结果表明，施加10 μmol/L和20 μmol/L浓度的褪黑素有助于棉花在15℃低温处理下种子的顺利萌发，减轻因低温带来的植株伤害，有利于棉花后期生长发育。其中，20 μmol/L褪黑素浓度处理对棉花种子的萌发效果最佳。

3.2 褪黑素对种子萌发期胚根的调节作用

当棉花种子萌发时所处温度低于正常发芽标准，将会导致胚根长度无法达到正常标准。研究发现，在砷胁迫的非生物胁迫生长环境下，水稻的生长发育状况较差，尤其表现在其根部长度和芽长，而通过施加外源褪黑素，可以减轻砷对作物的毒性作用，并增加水稻的根部长度和茎长[18]；通过对油菜花进行喷施适宜浓度的褪黑激素，发现其长势好于未喷施的对照组处理，这主要表现在低温下依旧生长发育状况良好，花芽数目的增多，根部干鲜重的增加[19-20]。本试验研究表明，在15℃低温胁迫下，通过施加10 μmol/L和20 μmol/L低浓度褪黑素，可增加低温胁迫下棉花种子萌发后胚根的长度。其中，20 μmol/L褪黑素浓度处理下，棉花种子萌发后胚根生长发育状况最好，接近正常萌发水平，而高浓度褪黑素则会抑制胚根的发育，其结果与萌发试验所得结论相一致。

3.3 褪黑素对种子抗氧化酶活性的调节作用

活性氧（ROS）的产生是因植物受到了低温胁迫，抑制了正常生长，使得MDA和H2O2含量大量增加，同时还会导致膜脂脱脂情况发生。通过对棉花进行一定浓度的外源抗坏血酸处理，发现棉花种子萌发期间抗氧化酶活性有所提升，棉花耐冷性增强[21]；在低温胁迫下，通过对番茄幼苗喷施外源褪黑素，发现SOD、POD、CAT活性增强，生长状况好于对照组[22-23]，各种抗氧化酶的活性在一定范围上发生变化，以维持作物细胞膜结构稳定性，同时保证其功能的完备性。褪黑素因其具备高亲脂性、部分亲水性的独特性质和去除活性氧的必需基团，因此可减轻ROS所带来的伤害[24-25]。本试验研究表明，在15℃低温条件下，棉花种子的SOD、POD、CAT活性，因施加不同浓度褪黑素处理有所升高，同时减轻了植物体细胞膜脂过氧化的损伤，种子耐低温能力在褪黑素的作用下也有所提升。其中20 μmol/L褪黑素浓度处理下，棉花种子抗氧化酶活性较好，抑制膜脂过氧化现象的产生，降低MDA和H2O2的含量，以此来减少低温条件下对棉花种子所带来的伤害，提高了棉花种子萌发期的耐低温特性。

4 结论

低于正常萌发温度将不利于棉花种子的发芽，10 μmol/L和20 μmol/L浓度的褪黑素有助于种子萌发和胚根伸长，提高抗氧化酶活性，减少MDA和H2O2的积累，缓解对细胞膜脂过氧化的伤害，增强对低温环境的抵抗能力；其中MT20褪黑素对低温胁迫下棉花种子萌发的调控效果最好。