Hsp60表达下调通过促进TGFBI分泌增强膀胱癌细胞侵袭转移

陈彦斌 ，张 波，夏先鹍，袁建林，杨 帆

(1.勉县县医院药剂科，陕西汉中 724200;；2.勉县红十字会医院，陕西汉中 724200；3.安康市中医医院，陕西安康 724299；4.空军军医大学第一附属医院西京医院泌尿外科，陕西西安 710032；5.空军军医大学第二附属医院唐都医院泌尿外科，陕西西安 710038)

膀胱癌是泌尿系最常见的恶性肿瘤之一，其可分为非肌层浸润性膀胱癌和肌层浸润性膀胱癌两种类型。非肌层浸润性膀胱癌恶性程度低，预后较好，然而当其进展为肌层浸润型膀胱癌时，其恶性程度显著升高且进展迅速预后极差，成为膀胱癌致死的主要原因[1]。因此探寻膀胱癌侵袭转移的机制成为膀胱癌临床监测及治疗亟待解决的棘手问题。

热休克蛋白60(heat shock protein 60,HsP60)是定位于线粒体内的蛋白伴侣分子，其能够以腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)依赖的方式促进线粒体蛋白的折叠在维持线粒体功能方面发挥着重要的作用[2]。研究发现肿瘤组织中Hsp60的表达存在显著异常且参与肿瘤的恶性进展[3-5]。膀胱癌组织中Hsp60表达下调能够显著影响膀胱癌的放化疗及免疫治疗效果[6-7]，然而Hsp60否参与膀胱癌的转移目前尚不清楚。

转化生长因子β诱导蛋白(transforming growth factor beta induced，TGFBI)是一种转化生长因子β诱导分泌的细胞外基质蛋白，又称βig-H3，能够与整合素α3β1、α5β3和α5β5等相互作用介导细胞的粘附和迁移[8-9]。研究发现膀胱癌细胞中TGFBI的表达及分泌显著增高且能够促进膀胱癌细胞发生上皮细胞-间充质转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)及转移[8,10]，然而何种因素导致膀胱癌细胞中TGFBI表达上调目前尚不完全明确。

本研究我们系统分析了Hsp60在膀胱癌组织的表达与膀胱癌分期分级的相关性，在膀胱癌细胞中敲低Hsp60表达后观察膀胱癌侵袭迁移能力的变化，以期发现膀胱癌转移的新机制为临床预防及治疗转移性膀胱癌提供新的靶分子。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器膀胱癌组织来源于西京医院泌尿外科2018年1月1日—2020年12月30日期间确诊及收治的95例膀胱癌患者，所有膀胱癌组织均经过病理确诊为膀胱癌，经石蜡包埋为组织石蜡块，后送南京弗瑞思生物科技有限公司制备为膀胱癌组织芯片。膀胱癌患者血清为同期西京医院泌尿外科收治的膀胱癌患者。所有参与实验的患者均签署了患者知情同意书并均经过西京医院伦理委员会审核通过。

人膀胱癌细胞株UM-UC-3细胞购自赛百慷(上海)生物技术股份有限公司(iCell Bioscience Inc，Shanghai)；MEM培养基购自Hyclone公司；胎牛血清购自生工生物工程股份有限公司；青链霉素混合液购自索莱宝公司；表达Hsp60shRNA的腺病毒载体构建及包装、TGFBI siRNA，HIF1α siRNA 以及Hsp60引物购自上海吉玛公司；实时定量PCR试剂盒购自TaKaRa公司；即用型免疫组化EliVisionTM plus试剂盒、加强型DAB Plus Kit购自福州迈新试剂公司；小鼠抗人Hsp60单克隆抗体、小鼠抗人β肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体购自Abcam公司；兔抗人HIF1α单克隆抗体购自Cell Signaling Technology公司；兔抗人TGFBI多克隆抗体购自Novus生物技术公司；MitoSOXTMRed线粒体超氧化物指示剂购自赛默飞世尔科技有限公司；TGFBI ELISA检测试剂盒购自Abcamb公司；FV1000共聚焦显微镜和YM310倒置显微镜购自Olympus公司；NovoCyte流式细胞仪购自艾森生物有限公司。

1.2 免疫组化检测膀胱癌组织Hsp60的表达将石蜡组织芯片经二甲苯单脱蜡后在体积分数为100%、95%、80%、75%的乙醇中进行水化，然后在10 mmol/L柠檬酸钠缓冲液(pH=6.0)中进行高压抗原修复(90 s)；待自然冷却后用PBS冲洗3 min×3次，3% H2O2的溶液孵育20 min祛除内源性过氧化物酶；PBS冲洗3 min×3次；非免疫山羊血清室温封闭20 min；4 ℃下加一抗体孵育过夜。用PBS洗涤5 min×3次；室温下加辣根过氧化物酶结合的EnVision+System二抗孵育2 h；PBS洗涤5 min×3次；加DAB显色3 min；自来水冲洗。苏木精染色进行复染；盐酸乙醇脱色1 s；自来水冲洗，淡氨水反蓝；然后梯度乙醇由低至高及二甲苯洗涤脱水。免疫组化结果评分评分由2名病理学家根据每张玻片(200倍放大)5个镜下视野内阳性细胞的比例和强度独立评估。比例评分表示估计的阳性染色肿瘤细胞比例，分配如下:0(0～9%),1(10%～25%),2(26%～50%),3(51%～75%) or 4(76%～100%)。强度评分表示阳性肿瘤细胞的平均强度，分为0(未染色)、1(弱染色)、2(中等染色)或3(深染色)。然后将比例和强度分数相乘得到总分，总分范围为0～12。

1.3 qPCR检测Hsp60稳定干涉膀胱癌细胞Hsp60的干涉效果使用Trizol从膀胱癌细胞分离总RNA，DNAse处理后利用SuperScript Ⅱ逆转录酶进行反转录。将得到的cDNA用于qRT-PCR模板，利用Hsp60引物5’-AAGCTCTAAGTACACT-CGTCTTGAATAGG-3’和5’-GCACCACCAGTAGCAATAGCCATAT-3’和β-actin为5’-TGACCCAGATCATGTTTGAG-3’和5’-CGTAC-AGGGATAGCACAG-3’。使用SYBR Green PCR商品化试剂盒扩增cDNA。每25 μL反应体积包含上述反转录生成的cDNA 2 μL,SYBR Green mix 12.5 μL，每对寡核苷酸引物10 μmol/L。循环参数开始于95 ℃ 5 min的初始变性步骤；95 ℃15 s,60 ℃ 30 s,72 ℃15 s，共40个循环。β-actin作为内参基因，采用2-△△Ct法计算目的基因mRNA的含量，每个样品做3个复孔，实验重复3次。

1.4 Western-blot检测Hsp60、TGFBI及HIF-1α等的表达将6孔板培养的细胞弃上清，PBS清洗3遍，用滤纸吸干残余液体，加70 μL RIPA裂解液及蛋白酶抑制剂，冰上孵育30 min,细胞刮子将裂解的蛋白刮至ependof管，4 ℃，12 000 r/min离心30 min，收集上清液为细胞总蛋白；BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度；5×蛋白上样缓冲液稀释，100 ℃煮沸10 min；SDS电泳分离蛋白；转膜至PVDC膜上；BSA封闭30 min；加抗Hsp60抗体(1∶1 000)，抗TGFBI抗体(1∶1 000)或者抗HIF1α抗体(1∶1 000)4 ℃过夜；TBST洗膜 5 min×3次；加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔/鼠IgG(1∶10 000)，室温孵育1 h；TBST洗5 min×4次；化学发光显影；每组实验至少重复3次。

1.5 Hsp60稳定干涉细胞系的建立膀胱癌细胞以6×105的密度接种至6孔板过夜，将包装好的携带Hsp60shRNA基因的腺病毒以感染复数(multi-plicity of infection，MOI)=5的密度加入膀胱癌细胞培养上清中，37 ℃孵育6 h后换液，用不含嘌呤霉素的培养基培养72 h后，加入含有嘌呤霉素的培养基加压培养1周后，qPCR及Western-blot检测干涉效果(shRNA-Hsp60:5’-TGCAGGCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGG-AGAATTTTTTC-3’)。

1.6 siRNA干涉膀胱癌细胞TGFBI或者HIF1α的表达膀胱癌细胞以5×105的密度接种至6孔板过夜，按照lipo3000说明书用无血清培养基配置lipo3000包裹siRNA的脂质体微球，弃去细胞上清加500 μL的无血清培养基，将配置好的包裹siRNA的脂质体微球点状均匀加至细胞培养上清中，米字摇晃，37 ℃培养6 h后,换含血清的正常培养基，72 h后，Western-blot检测干涉效果(TGFBI siRNA：CGGGAAGGCGATCATCTCCAA；HIF1α siRNA：GCAAGGCCTTACATGTTAA；siRNA Ctrl：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’)。

1.7 ELISA检测细胞培养上清TGFBI的浓度Hsp60稳定干涉的膀胱癌细胞及对照组细胞培养48 h后收集上清。按照TGFBI ELISA检测试剂盒中说明书的操作方法进行检测;膀胱癌患者外周血需取3 mL于无抗凝管中，2 h之内分离血清，-80 ℃ 保存，然后使用ELISA检测试剂盒。

1.8 Transwell实验检测干涉Hsp60表达后膀胱癌细胞侵袭转移能力的改变将Hsp60稳定干涉的膀胱癌细胞及对照组细胞以3×104的密度接种至铺有Matrige胶或者没有铺Matrige胶的Transwell小室的上室中，下腔室含有0.6 mL含100 g/L胎牛血清的培养基。细胞孵育12 h(转移)或24 h(侵袭)后,取上室用棉签擦去小室内部未穿出的细胞，用40 g/L多聚甲醛固定上室穿出的细胞，用40 g/L结晶紫溶液染色。显微镜下以20倍放大率捕捉5个随机视场进行分析。每个样品设3个复孔。

1.9 划痕实验检测干涉Hsp60表达后膀胱癌细胞迁移能力的改变在24孔板上接种膀胱癌细胞，待细胞密度长至80%时，用200 μL移液枪的枪头在24孔培养板划一条等宽的直线，用无血清培养基将划落的细胞清洗干净后再加无血清培养基继续培养，12 h在20倍物镜下捕捉图像。采用Image J软件(NIH,MD,USA)计算创面愈合面积。迁移率(%)=(0 h创面面积12 h或者24 h创面面积)/0 h创面面积×100%。

1.10 MitoSOX检测线粒体活性氧的变化将膀胱癌细胞接种至6孔板，待细胞密度长至70%左右时弃去细胞培养上清。用PBS洗3次，用无血清培养基按比例1∶1 000稀释加DCFH-DA荧光探针，在细胞培养箱中孵育25 min，弃去上清，PBS洗涤3次，再加入无血清培养基。共聚焦显微镜下摄取荧光图片，并计算荧光强度。每个样品3个复孔。

2 结 果

2.1 膀胱癌组织Hsp60表达降低与膀胱癌的分化及临床密切相关免疫组化检测膀胱癌组织Hsp60蛋白的表达，结果显示：Hsp60蛋白局限性表达在膀胱癌细胞的胞质中，且在浸润性膀胱癌组织中的表达水平显著低于非浸润性膀胱癌组织(图1A),免疫组化评分进一步确认：与非浸润性膀胱癌组织相比，Hsp60在浸润性膀胱癌组织中的表达显著降低(图1B)。根据免疫组化评分中位数(5.468±1.846)将膀胱癌患者分为Hsp60高表达组及Hsp60低表达组。统计学分析结果进一步证实：膀胱癌组织Hsp60的表达与膀胱癌的临床分期，分级以及复发等显著相关，而与膀胱癌患者的年龄、性别、饮酒史、抽烟史等没有显著的相关性(表1)。

A：免疫组化检测Hsp60蛋白的表达差异；B：Hsp60的免疫组化评分值。图1 免疫组化检测膀胱癌组织Hsp60蛋白的表达

表1 Hsp60表达与膀胱癌患者临床参数的相关性 [例(%)]

2.2 干涉Hsp60表达膀胱癌细胞的侵袭迁移能力显著增强利用表达Hsp60shRNA的重组腺病毒载体感染膀胱癌细胞UM-UC-3，构建Hsp60稳定干涉的膀胱癌细胞株。qPCR及Western-blot检测Hsp60的干涉效果，结果显示：稳转细胞中Hsp60的mRNA及蛋白表达均被显著抑制(图2A、B)。进一步检测Hsp60表达变化对膀胱癌细胞侵袭转移的影响。Transwell实验结果显示：干涉膀胱癌细胞Hsp60表达后，膀胱癌细胞的侵袭迁移能力均显著增强(图2C)。划痕实验进一步证实：Hsp60干涉后膀胱癌细胞的迁移能力显著增强(图2D)。这些结果均提示：Hsp60表达降低能够增强促进膀胱癌细胞的侵袭转移。

A:qPCR检测Hsp60 mRNA的表达；B：Western-blot检测蛋白的表达；C：Transwell实验检测膀胱癌细胞的侵袭迁移；D：划痕实验检测膀胱癌细胞迁移。图2 干涉Hsp60表达后，检测膀胱癌细胞侵袭转移能力的改变

2.3 干涉膀胱癌细胞Hsp60表达促进TGFBI的表达RNA-Seq分析结果显示：与对照组相比，Hsp60稳定干涉膀胱癌细胞中TGFBI基因的表达显著升高(图3A)。Western-blot检测Hsp60表达对TGFBI蛋白的影响，结果显示：干涉Hsp60表达后，膀胱癌细胞中TGFBI蛋白表达较对照组显著升高(图3B)。ELISA检测结果显示：与对照组相比，Hsp60干涉的膀胱癌细胞培养上清中TGFBI的分泌也显著增加(图3C)。进一步检测18例Hsp60高表达膀胱癌患者及20例Hsp60低表达膀胱患者血清中TGFBI水平，结果显示：Hsp60低表达膀胱癌患者血清中TGFBI的表达水平显著高于Hsp60高表达膀胱癌患者血清中的TGFBI(图3D)。这些结果均提示：Hsp60表达降低促进了TGFBI的表达。

A：RNA-seq分析基因的差异表达；B：Western-blot检测Hsp60及TGFBI蛋白；C：ELISA检测培养上清中的TGFBI蛋白；D：ELISA检测血清TGFBI蛋白。图3 Hsp60对TGFBI表达的影响

2.4 膀胱癌细胞中Hsp60表达降低通过促进TGFBI促进膀胱癌细胞转移文献报道TGFBI是促进肿瘤侵袭转移重要因素，因此我们进一步探索干涉Hsp60表达能否通过TGFBI促进膀胱癌细胞的侵袭迁移。利用TGFBI siRNA特异性阻断Hsp60稳定干涉膀胱癌细胞中TGFBI的表达，Transwell结果显示：干涉TGFBI表达后，Hsp60表达降低导致的膀胱癌细胞侵袭迁移能力增强被显著抑制；同时划痕实验也证实：干涉TGFBI后，Hsp60表达降低所导致膀胱癌细胞迁移能力增强也被显著抑制。这些结果均提示：干涉Hsp60表达所导致的膀胱癌细胞的侵袭迁移是通过TGFBI介导的。

2.5 干涉Hsp60表达降低通过ROS/HIF1a通路促进TGFBI的表达我们首先检测膀胱癌细胞Hsp60表达降低能否影响ROS/HIF1α信号通路。MitoSOX染色结果显示：干涉Hsp60表达后，膀胱癌细胞内线粒体ROS的水平显著升高(图5A、B)；同时Western-blot结果显示：干涉Hsp60表达后，膀胱癌细胞内HIF1α的表达显著升高(图5B)。利用MitoTEMP祛除Hsp60稳定干涉膀胱癌细胞内的线粒体ROS后，Western-blot结果显示：Hsp60干涉导致的HIF1α及TGFBI表达升高均被显著抑制(图5C)；同时利用siRNA干涉Hsp60稳定干涉膀胱癌细胞内的HIF1α表达后，发现Hsp60敲低导致TGFBI表达升高也被显著抑制(图5D)。这些结果提示:干涉Hsp60表达诱导的TGFBI表达是通过ROS/HIF1α通路调控的。

A、B：Transwell实验检测膀胱癌细胞的侵袭迁移；C、D：划痕实验检测膀胱癌细胞的迁移。图4 干涉TGFBI显著抑制Hsp60干涉导致的膀胱癌细胞侵袭迁移增强

A：MitoSOX检测膀胱癌细胞ROS水平；B：统计学分析膀胱癌细胞ROS水平；C～E：Western-blot;C：干涉Hsp60表达显著增加膀胱癌细胞HIF1α的表达；D:MitoTEMP去除线粒体ROS，可显著降低Hsp60稳定干涉膀胱癌细胞内TGFBI的表达；E:HIF1α siRNA膀胱癌可显著降低Hsp60稳定干涉膀胱癌细胞内TGFBI的表达。图5 干涉Hsp60表达可通过ROS/HIF1α信号通路促进膀胱癌细胞TGFBI的表达

3 讨 论

本研究揭示了Hsp60在浸润性膀胱癌组织中的表达较非浸润性膀胱癌组织显著降低，统计学分析结果显示：Hsp60表达与膀胱癌患者的临床分期、分级及复发显著相关。细胞学实验证实：干涉Hsp60表达可通过ROS/HIF1α信号通路上调TGFBI表达促进膀胱癌细胞的侵袭转移。

以往的研究发现Hsp60与肿瘤的侵袭转移密切相关[3]。PISELLI等[11]发现Hsp60与CD44v5/v6,ICAM-1等协同表达能够促进胰腺癌的转移。另有研究发现Hsp60在结直肠癌组织中异常表达与结直肠癌的淋巴结转移密切相关[5]。ZHANG等[12]研究发现肝癌组织Hsp60表达显著下调且能够促进肝癌细胞的去分化及侵袭转移。膀胱癌组织Hsp60表达下调与膀胱癌患者预后不良有关[13]。在侵袭性或高危浅表性膀胱癌中，Hsp60表达低的膀胱癌患者其对新辅助化疗的反应性越差[7]。我们的研究发现：与非浸润性膀胱癌相比，Hsp60在浸润性膀胱癌组织中的表达显著降低。干涉Hsp60表达后，膀胱癌细胞的侵袭迁移能力显著增强，我们的研究揭示了Hsp60表达降低促进膀胱癌恶性进展具体机制，为预测膀胱癌的转移提供了新的标记分子同时为转移性膀胱癌的治疗提供了新的潜在靶点。

TGFBI作为一种细胞外基质蛋白其能够通过与黏附素结合，激活金属蛋白酶或者促进新生血管生成等方式促进肿瘤细胞的侵袭转移[14]。在转移性结直肠癌中TGFBI的表达显著上调且与肿瘤分级和转移潜能的增加相关[15]。在骨肉瘤、前列腺癌细胞中抑制TGFBI表达可显著降低肿瘤的转移[16-17]。在胰腺癌症转移模型中，分离出血液循环癌细胞，这些细胞在体内和体外都有高的转移潜能，通过对这些高恶性细胞的mRNA分析发现，TGFBI是原发和恶性胰腺癌细胞株中变化幅度最大的基因[18]。乳腺癌细胞中TGFBI的表达升高能够促进乳腺癌细胞发生EMT及转移[9]。膀胱癌细胞TGFBI表达显著上调且能够增强膀胱癌细胞的侵袭转移[10]。我们的研究发现干涉膀胱癌细胞Hsp60表达能够显著促进TGFBI的表达，利用siRNA阻断膀胱癌细胞Hsp60干涉膀胱癌细胞内TGFBI的表达可显著抑制Hsp60表达下调导致的膀胱癌细胞侵袭转移潜能增加。我们的研究揭示了Hsp60表达下调促进膀胱癌转移的新机制。

TGFBI的表达受缺氧诱导因子HIF-1的调控[18]。活性氧不仅在缺氧条件下上调HIF-1的表达，还可以在多种应激状态下上调HIF1的表达。Hsp60是维持线粒体活氧化呼吸链ROS生成的重要因素[19]。在胶质母细胞瘤细胞中干涉Hsp60表达能够显著上调细胞内ROS水平。蛋白组学分析揭示：Hsp60沉默增能够导致线粒体氧化呼吸链复合物I亚基的下调,导致呼吸链功能紊乱，产生过量的ROS[20]。我们的研究发现干涉Hsp60表达后，膀胱癌细胞ROS水平及HIF1a的表达均显著升高。清除ROS或者抑制HIF1a表达均可抑制Hsp60干涉导致TGFBI表达上调，提示膀胱癌细胞Hsp60下调通过ROS/HIF1a信号通路促进膀TGFBI表达。

我们的研究揭示了Hsp60在膀胱癌组织表达下调促进膀胱侵袭转移的作用及机制，为临床膀胱癌侵袭转移的监测及治疗提供新的潜在靶点。