美国白蛾成虫对水曲柳活性挥发物的触角电位和行为反应

马庆辉，王 楷，任英杰，张书曼，赵佳齐，方 静，孟昭军

（东北林业大学林学院,哈尔滨150040）

美国白蛾（Hyphantriacunea）又名秋幕毛虫、网幕毛虫，在最新分类系统中属于鳞翅目（Lepidoptera）、目夜蛾科（Erebidae），是一种重大入侵性食叶害虫[1]。当前在我国南方已抵长江南岸，北方已过长春北郊，扩散至13个省市区、598个县，且依然有向外蔓延的趋势，给我国林业造成了极大的经济损失[2]。当前对美国白蛾的防治主要还是以化学防治为主，对环境造成严重污染，因此，如何有效地生态防控美国白蛾的蔓延是当前的研究重点。水曲柳材质坚硬，是我国用材林、防护林、风景林等造林的优良树种，呈现为零星分布，在我国群落面积总计448.78万hm2，主要分布于我国黑龙江省的大兴安岭东部，小兴安岭和吉林省的长白山林区，用材价值是针叶林的4～5倍，是红松阔叶混交林主要建群树种，其作为美国白蛾的喜食寄主受大极大威胁[3]。

植物与昆虫在长期的自然选择和协同进化过程中，形成了一套复杂的化学通信系统，可通过挥发性次生代谢物质调控寄主定位、取食、交尾、产卵选择等种间和种内的关系，对害虫起到防控作用[4-5]。ANASTASAKI等[6]通过试验发现，被侵害的番茄(Lycopersiconesculentum)植株会释放己醛、(Z)-3-己烯-1-醇、水杨酸甲酯和吲哚等多种对雌性番茄斑潜蝇(Tutaabsoluta)有强烈驱避反应的物质，促使其到未被侵害的对照植株上产卵。FATOUROS等[7]试验发现，卷心菜粉蝶(Pierisbrassicae)在寄主植物上产卵后会使寄主排斥其他妊娠期粉蝶靠近，还会吸引天敌寄生蜂[甘蓝赤眼蜂(Trichogrammabrassicae)和粉蝶盘绒茧蜂(Cotesiaglomerata)]。此外，蒋世雄等[8]试验发现，单一使用植物挥发物对黏虫(Mythimnaseparata)的吸引力较小，但将苯乙醛、β-石竹烯、Z-3-己烯基乙酸酯和黏虫性诱剂混合组合的引诱效果是单独使用性诱剂的1.8倍。BAI等[9]研究发现，苯二甲酸二丁酯和叶绿醇可以促进美国白蛾雌性成虫产生交尾行为。TANG等[10-11]在桑树挥发物中发现，β-罗勒烯可以诱导70%的雌虫进行产卵行为，其次是挥发物混合物，最少的是其他挥发物和对照组，产卵率是顺式-2-戊烯-1-醇的4倍。所以，通过人工合成这些来源于植物或昆虫的活性气味分子去诱杀成虫，减少后代种群数量，或干扰害虫的取食、产卵、交尾等行为，可以达到绿色防控美国白蛾的目的。

本研究通过动态顶空吸附法收集了寄主植物水曲柳的挥发物，利用气相色谱-触角电位联用（GC-EAD）和气相色谱-质谱联用（GC-MS）确定水曲柳挥发物中对美国白蛾有活性挥发物的成分，最后通过EAG和风洞模拟试验对这些活性挥发物不同浓度标准物进行功能分析，确定其对美国白蛾有吸引和驱避作用，以期为研制美国白蛾驱避剂或引诱剂奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试昆虫 本试验所用的美国白蛾卵块由中国林业科学院森林生态环境与保护研究所提供。将美国白蛾卵块先用10%甲醛溶液进行消毒，后用蒸馏水冲洗3次，自然风干后进行恒温孵化饲养。将初孵幼虫放入养虫盒中，置于温度为(24±3)℃、湿度为30%～50%、光周期L/D为14L∶10D的恒温箱下，使用人工饲料饲养至化蛹。幼虫化蛹后，将雌蛹和雄蛹分放在不同的养虫盒中待羽化，成虫羽化后用蘸有10%蜂蜜水的脱脂棉球进行饲喂保存。选取羽化8h后的未交尾雌、雄美国白蛾成虫进行试验。同时在蛹期选取雌蛹和雄蛹各5只，放置在同一个养虫盒中待羽化，选择使用雌、雄性美国白蛾成虫交尾行为结束1h后的成虫进行试验。

1.1.2 供试苗木 试验选用3年生水曲柳作为供试苗木，每16棵同种苗木为1组，共3组。于2019年5月1日移栽到大号育苗盆（外径30cm，内径28cm，高40cm）中，盆下配有底座。每3～5d浇1次水，种树用土为草甸土∶本地土∶蛭石=2∶2∶1均匀混合而成。

1.1.3 仪器 气相色谱-质谱联用仪（6890N-5975C，美国安捷伦科技有限公司）、气相色谱-触角电位联用仪（7890A-EAD，美国安捷伦科技有限公司；德国Syntech公司）、数据采集控制器IDAC-4、气味刺激控制装置CS-55。

1.1.4 供试试剂 α-蒎烯、β-蒎烯、3-蒈烯、1，3-二甲基苯、1，4-二甲基苯、对异丙基甲苯、4-异丙基苯甲醇、4-乙基苯乙酮均购于美国Sigma-Aldrich公司，纯度均≥98%；3-乙基苯乙酮、β-水芹烯购于北京百灵威科技有限公司，纯度均≥99%；正己烷、二氯甲烷（色谱级，美国Fisher公司）；液体石蜡（富宇化工有限公司）；吸附剂PorapakTMQ（60～80目，美国supelco公司）。

1.2 方法

1.2.1 植物挥发物的采集与鉴定 从3组水曲柳供试苗木中各选取1株发育良好、且没有虫蛀的试验苗木作为1次重复，共3次重复。在室外条件下通过动态顶空吸附法对水曲柳进行活体挥发物采集，收集植物1d内自然释放的所有挥发性物质。收集时用特大号保鲜袋作为挥发物采样袋，在其入气口依次连接加湿瓶、活性炭管和气泵，出气口依次连接装有100mg PorapakTMQ的吸附管和气泵。进气口空气流量为600mL·min-1，出气口流量为500mL·min-1，持续吸附4h，尽量减少树干损伤对实验结果的影响。将采集过植物挥发物的吸附管用铝箔纸和封口膜包裹，带回实验室后分别用色谱级正己烷和二氯甲烷进行洗脱，将洗脱液存放在棕色样品瓶中，冷冻保存备用。

GC：色谱柱采用HP-5，柱温箱起始温度是50℃，以5℃·min-1升至120℃，再以10℃·min-1升至250℃，260℃为后运行温度。以高纯氮气作为载气，氢气流量为40mL·min-1，空气流量为400mL·min-1，气谱接口温度为250℃。

MS色谱柱采用HP-5MS：气谱-质谱接口温度250℃，EI离子源，扫描范围30～500m·z-1，离子源和四级杆温度分别为250℃和150℃，扫描频率为5次·s-1。

通过NIST10.0谱库对水曲柳挥发物组分进行定性分析，并参照标准图谱对全部检索结果进行核对补充检索，定量分析则采用峰面积归一化法确定各成分的相对百分含量。

1.2.2 美国白蛾EAG测试 将待测试的气味标准物以液体石蜡为溶剂，配制成5个浓度梯度：100，10，1，0.1，0.01，0(CK)μg·μL-1，装在10mL的样品瓶中，于-4℃冰箱中备用。用移液器取10μL待测样品溶液均匀涂抹到对折的滤纸条（0.4cm×4cm）上，将滤纸条放入巴斯德吸管中，吸管末端插到气体刺激控制装置中，1min之后待测样品溶液开始挥发，开始刺激美国白蛾触角。整个EAG试验设置刺激的时间为0.5s，两次刺激之间的时间间隔为30s，空气流速设为200mL·min-1，每组样品3次重复。EAG相对反应值计算公式为[12]：

1.2.3 风洞模拟试验 风洞类型为推风式水平风洞。风洞室底长度2.5m，宽和高各为2m，四周由有机玻璃组成，最大风速可达0.8m·s-1。风洞光源放置在风洞上方2.5m处，由10只红色灯泡（11W）组成。风洞室内温度为(23±1)℃，湿度为(60±10)%RH。风洞室被分为3个不同区域：距待测样品2m处为释放成虫起始线a；起始线a与标准线b间距1.2m，该区域为逆向飞行区，指通过标准线b，则记为成虫逆风飞行完成；标准线b与标准线c间距0.6m，该区域为接近味源区，指通过标准线c，则记为成虫接近味源。在样品区又分成4个相同小区域，每个区域放一个待测样品，当成虫在任一小区域着落，则记为成虫对该区域待测样品选择（图1）[13]。

图1 风洞装置内部区域划分主视图（上）和俯视图（下）Figure 1 Regional division of wind tunnel installation main view(upper)and top view(lower)

试验时，待测样本及对照依次放置在风洞室的样品区的透明塑料板上，每次试验后更换透明塑料板。其中对照为液体石蜡，待测样本为3种浓度：0.01，1，100μg·μL-1同一种活性挥发物。在上风试验时取1mL的待测液滴到2×3cm的滤纸条上，每次在起始点处释放15只待测美国白蛾成虫，一共进行5组试验，每次试验需要将供试成虫移入风洞条件下适应3～5min，每次测试为20～25min，试验观察美国白蛾成虫的逆风飞行率、接近味源率和样品选择率。

风洞试验中的逆风飞行率、接近味源率计算公式为[14]：

1.3 数据分析方法

利用SPSS21.0对数据进行分析，利用One-Way ANOVA单因素方差分析法对美国白蛾不同交尾状态和对不同种活性挥发物的触角电位测试结果进行差异显著性分析，使用LSD进行多重比较；在风洞试验中对逆向飞行率、接近味源率、样品选择率采用单因素方差分析法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 水曲柳对美国白蛾成虫的活性挥发物鉴定

由图2可知，GC-EAD和GC-MS共鉴定水曲柳6个时间段活性挥发物共9种，分别为β-蒎烯、β-水芹烯、3-蒈烯、1，3-二甲基苯、1，4-二甲基苯、对异丙基甲苯、4-异丙基苯甲醇、4-乙基苯乙酮和3-乙基苯乙酮。

图2 雌性和雄性美国白蛾成虫触角对水曲柳植物挥发物的响应Figure 2 Response of female and male H.cunea to plant volatiles of F.mandshurica.

6个时间段内所释放的活性挥发物有较大差异，其中，不同时间段内相对含量较高的挥发物是1，3-二甲基苯、1，4-二甲基苯，相对含量占所有挥发物的90%以上，结果见表1。3-蒈烯在18∶00～22∶00、22∶00～2∶00时间段相比于其他时间段的相对含量显著降低（p＜0.05），数值均为(0.14±0.01)%；而β-蒎烯在10:00～14:00、14∶00～18∶00的相对含量最高（p＜0.05），数值为(0.30±0.22)%和(0.24±0.19)%；且4-异丙基苯甲醇、3-乙基苯乙酮和4-乙基苯乙酮在14:00～18:00的相对含量最高（p＜0.05），分别为(1.63±0.81)%、(1.65±0.69)%、(2.33±0.97)%。

表1 美国白蛾成虫触角对水曲柳挥发物有电位反应的挥发物及相对含量Table 1 Components and relative contents of potential response of adult H.cunea to volatiles from F.mandshurica

2.2 美国白蛾成虫对水曲柳活性挥发物的触角电位反应

由图3可知，未交尾雌性、雄性和已交尾雌性美国白蛾成虫触角对3-蒈烯、β-水芹烯、1，3-二甲基苯、3-乙基苯乙酮、1，4-二甲基苯、对异丙基甲苯的EAG相对反应值随着浓度的升高而显著升高（p＜0.05）；而未交尾雌性，成虫触角对β-蒎烯的反应随着浓度的升高呈现出先增高后降低的现象，其最大值为122.25±3.99（p＜0.05）；已交尾雌性美国白蛾成虫触角对4-乙基苯乙酮的反应呈先升高后降低趋势，其最大值为140.16±8.31（p＜0.05）。

图3 未交尾雌雄蛾和已交尾雌蛾对9种活性物质在不同浓度下的EAG相对反应值Figure 3 EAG response values of females,males and mated females H.cunea to 9 active substances at different concentrations

不同生理状态的美国白蛾成虫触角对同种物质在同种浓度下的差异化比较显示；在浓度为10μg·μL-1时，未交尾雌性触角对β-水芹烯显著高于未交尾雄性（p＜0.05），其EAG相对反应值为179.41±9.43；在浓度为1μg·μL-1时，未交尾雌性美国白蛾成虫触角对β-蒎烯的EAG相对反应值显著高于未交尾雄性（p＜0.05），为121.64±11.66；在浓度为10μg·μL-1和100μg·μL-1时，未交尾雌性成虫触角对3-蒈烯的EAG的相对反应值显著高于未交尾雄性（p＜0.05），其数值分别为158.69±13.44和230.58±8.96。在浓度为100μg·μL-1时，已交尾雌性成虫触角对1，4-二甲基苯的EAG相对反应值显著高于未交尾雌性（p＜0.05），其数值为166.68±8.27；在10μg·μL-1和100μg·μL-1的浓度下，已交尾雌性成虫触角对1，3-二甲基苯的EAG相对反应值显著高于未交尾雌性（p＜0.05），其数值分别为141.08±5.92和143.69±9.71；在浓度为0.01μg·μL-1和0.1μg·μL-1时未交尾雌性成虫触角对1，3-二甲基苯的EAG相对反应值显著高于未交尾雄性(p＜0.05)，其数值分别为109.57±9.87和121.65±7.66；在浓度为100μg·μL-1时，未交尾雄性成虫触角对3-乙基苯乙酮的EAG相对反应值显著高于其他生理状态（p＜0.05），其数值为138.07±7.66；在浓度为0.1～1μg·μL-1时，已交尾雌性成虫触角对4-乙基苯乙酮的EAG相对反应值显著高于未交尾雌性（p＜0.05），其数值为138.40±9.74、144.02±7.16；在100μg·μL-1的浓度下未交尾雄性美国白蛾成虫触角对4-乙基苯乙酮显著高于未交尾雌性（p＜0.05），其数值为140.16±8.31。而4-异丙基苯甲醇对美国白蛾成虫的EAG相对反应值随浓度变化不明显。

2.3 风洞模拟测试

由于雌性美国白蛾成虫在植物寄主选择中起到关键性作用，所以挑选引起雌蛾成虫有明显EAG反应的4种活性挥发物进行风洞模拟试验。风洞模拟试验结果表明，3-蒈烯对未交尾雌蛾和已交尾雌蛾的引诱率显著高于其他活性挥发物（p＜0.05）(图4)，选择率分别为(82.22±8.31)%和(75.56±3.14)%。且3-蒈烯对未交尾雌性和已交尾雌性美国白蛾成虫的接近味源率也显著高于其他活性挥发物（p＜0.05）(图5)，选择率分别为(60.00±11.33)%和(53.33±5.44)%。而未交尾雄虫对所有挥发物及对照的逆向飞行率和接近味源率的差异均不显著(p＞0.05)。

图4 美国白蛾成虫对4种活性挥发物逆向飞行率的比较Figure 4 Comparison of reverse flying rates of four active volatiles of H.cunea

图5 美国白蛾成虫对4种活性挥发物接近味源率的比较Figure 5 Comparison of approaches to flavor source rate of four active volatiles of H.cunea

3 讨论与结论

寄主植物释放的挥发性信息物质在蛾类昆虫的行为活动中起关键性作用。本研究共鉴定9种活性挥发物：β-蒎烯、β-水芹烯、3-蒈烯、1，3-二甲基苯、1，4-二甲基苯、对异丙基甲苯、4-异丙基苯甲醇、4-乙基苯乙酮和3-乙基苯乙酮。这9种挥发物均能使美国白蛾雌性触角产生明显的电生理反应，其中7种能使雄性成虫产生显著地电生理反应。这些挥发物的日节律变化表明，3-蒈烯在18∶00～22∶00和22∶00～2∶00相对含量最低，数值均为(0.14±0.01)%；而4-异丙基苯甲醇、3-乙基苯乙酮、4-乙基苯乙酮在2∶00～6∶00相对含量最高，数值分别为(1.63±0.81)%、(1.65±0.69)%、(2.33±0.97)%。推测这几种挥发物在美国白蛾远距离定位取食寄主、交尾或产卵等行为中起重要作用。

本研究中鉴定的化合物对昆虫EAG活性的报道已有很多。例如，孙小旭等[15]鉴定蓝桉(Eucalyptusglobulus)的次生代谢物3-蒈烯和β-水芹烯可以使光肩星天牛(Anoplophoraglabripennis)成虫产生强烈的EAG反应。而管维康等[16]发现，对异丙基甲苯、4-异丙基苯甲醇、3-乙基苯乙酮、4-乙基苯乙酮可以引起朱红毛斑蛾(Phaudaflammans)雌雄虫的触角电位反应。徐伟等[17]也发现，β-蒎烯对雄性中华弧丽金龟甲(Popilliaquadriguttata)成虫具有显著驱避作用，本研究与其一致。美国白蛾成虫对3-蒈烯的EAG相对反应值最高，且具有显著趋向性。王琪等[18]研究寄主植物红松(Pinuskoreiensis)的挥发物作用时，发现3-蒈烯可以使松梢象(Pissodesnitidus)产生显著EAG反应，且对松梢象有吸引作用，与本研究一致。刘敏等[19]在松树挥发物中也鉴定出3-蒈烯，对红脂大小蠹(Dendroctonusvalens)具有吸引作用。而唐睿等[20]对美国白蛾进行触角电位反应试验时发现，美国白蛾成虫主要以6个碳的醛、醇和酯为主的绿叶气味有强烈EAG活性，与本文不一致。原因可能是树种挥发物不同。在本研究中，水曲柳挥发物中90%以上是烷烃类物质，且基本上都带有苯环，而醛、醇和酯类的绿叶气味只有4种，且未对美国白蛾成虫的GC-EAD分析中产生活性。

昆虫性别和生理状态影响其对植物挥发物的选择。通常情况下，雄虫为与雌虫优先交尾，对性信息素类似物的敏感性较强；而雌虫为寻找适宜的产卵寄主，对植物挥发物的敏感性较强[21]。本研究发现，在100μg·μL-1浓度下，已交尾成虫对β-水芹烯、1，3-二甲基苯、对异丙基甲苯、3-乙基苯乙酮的EAG相对反应值显著高于未交尾雄、雌性成虫(p＜0.05)，说明雌虫对产卵寄主的敏感性，且这种敏感性可能与触角感器的类型或数量有关，如狄贵秋等[22]对美国白蛾触角感器进行电镜扫描后发现，雄性白蛾特有舌型感器大小在雌雄之间差异显著，且雄性白蛾的毛状感器明显多于雌性。而DAS等[23]研究马铃薯块茎蛾(Phthorimaeaoperculella)对绿叶挥发物中的脂肪酸衍生物的反应时发现，雌性比雄性更敏感。且贾云程等[24]发现，雌性斑鞘豆叶甲(Colposcelis signata)对大豆叶片挥发物的EAG反应和嗅觉反应均强于雄虫，结论与本研究一致。

昆虫对寄主植物挥发物的触角电位反应强弱与昆虫行为不一定一致。在本研究中，未交尾雄性对1，3-二甲基苯产生显著的EAG反应，但在风洞模拟试验中却对未交尾雌性成虫产生了吸引作用，而对未交尾雄性成虫没有明显作用，说明植物中一些挥发物本身对美国白蛾成虫没有明显的引诱作用，甚至会产生驱避作用，但这些物质可能会作为背景气味物质来增强其他重要活性挥发物的识别，或是在混合物中起作用[25]。张凡等[26]研究表明，在枸杞(Lyciumbarbarum)挥发物中顺-3-己烯-1-醇、顺-3-己烯乙酸酯和月桂烯可以对雌性枸杞红瘿蚊(Jaapiellasp.)产生明显电位变化，但对雌性枸杞红瘿蚊没有产生明显的驱避与引诱作用，与本研究一致。且JU等[27]的研究发现，将植物挥发物乙酸-反-2-己烯酯与性信息素3∶1混合后对性信息素诱捕雄性暗黑鳃金龟(Holotrichiaparallela)增效175%；VON等[28]研究表明，在性信息素中混入植物挥发物(E)-β-香樟烯、(Z)-3-乙酸己烯酯、1-己醇或1-辛烯-3-醇，可以激活雄性葡萄小卷蛾(Lobesiabotrana)对性信息素的嗅觉反应，减少对其雌性卷蛾的寻找时间。

综上，共有9种水曲柳挥发物可以使雌、雄性美国白蛾成虫触角产生活性反应。风洞模拟试验结果发现，3-蒈烯对美国白蛾成虫有显著的吸引作用，这为美国白蛾驱避和引诱剂的开发提供了理论依据。但昆虫对植物的识别是一个复杂的过程，气味混合及其浓度和比例共同发挥作用，和各挥发物的比例及浓度等都需要进一步研究。