基于SSR标记的东北杏遗传多样性分析及指纹图谱构建

董胜君，王新鑫，张皓凯，陈建华，刘权钢，徐 豪

（沈阳农业大学林学院，沈阳110161）

东北杏（Armeniacamandshurica）为蔷薇科（Rosaceae）李亚科（Prunoideae）杏属（Armeniaca）乔木，原产于辽宁、吉林[1]，在东北三省、俄罗斯远东地区及朝鲜半岛北部均有分布。东北杏树体高大，花果可赏，可做园林应用；其根系发达，落叶丰富，抗逆性强，是东北地区营建水源涵养林的优良树种；东北杏种仁的苦杏仁甙含量丰富，外用抗炎杀菌[2]，内服镇咳平喘[3]，药用价值高；种仁含油率高于47%，且油脂脂肪酸组成及生物柴油燃料性能表现良好[4]，是极具开发潜力的树种，具有重要的生态、经济和社会价值。

目前，东北杏多数处于野生、半野生状态[5]，分析其遗传多样性能为东北杏种质资源的保护利用提供理论指导。利用分子标记技术研究植物遗传多样性，相比表型性状[6]而言，能够直接反映遗传物质差异，且不受到季节、环境等因素影响。SSR分子标记技术具有共显性、多态性、可重复性等优点，因而广泛应用于遗传多样性分析[7-11]。在杏属植物中，SSR引物开发成熟且通用性高，前人应用SSR标记对普通杏（PrunusarmeniacaL.）[12]、新疆野杏（ArmeniacavulgarisLam.）[13]、西伯利亚杏（Prunussibirica）[14]、梅（Prunusmume）[15]等进行了遗传多样性分析，而东北杏的相关研究鲜见报道。自然界中东北杏遗传多样性丰富，普遍存在种间杂交现象[16]，基于表型性状鉴定东北杏种质则存在一定的难度。应用SSR标记构建的SSR指纹图谱，具有高度个体特异性和环境稳定性，能从分子水平上更为精确地鉴定种质，已广泛应用在苹果属（MalusMill.）[17]、甜樱桃（PrunusavinumL.）[18]、榴莲（Duriozibethinus）[19]、无花果（FicuscaricaLinn.）[20]、油茶（CamelliaoleiferaAbel.）[21]等树种的种质鉴定中。

本研究以来自10个种源的61份东北杏种质为试验材料，基于SSR分子标记技术对东北杏的遗传多样性进行评价，探讨东北杏遗传距离与地理距离的相关性，并构建东北杏SSR指纹图谱，旨在为东北杏种质资源的有效保护利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

选取东北杏自然地理分布区10个种源的61份东北杏种质作为供试材料，辽宁省包括32份种质，其中，丹东市3份，本溪市6份，抚顺市6份，沈阳市17份；吉林省包括17份种质，其中，白山市3份，吉林市8份，延边朝鲜族自治州6份；黑龙江省包括12份种质，其中，牡丹江市4份，哈尔滨市5份，鸡西市3份。具体地理位置信息见图1。

图1 61份东北杏种质的地理分布Figure 1 Geographical distribution of 61 Armeniaca mandshurica germplasms

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取、PCR扩增及检测 选用TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒提取东北杏样木阳面1年生枝条上嫩叶的DNA。利用1%的琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计对DNA的质量和浓度检测后，置于-20℃冰箱中保存。依据课题组前期测序结果，由北京赛百盛生物工程有限公司合成600对SSR引物，从中选择101对扩增条带清晰、多态性高的引物，并按照SSR-PCR反应体系[22]进行扩增。利用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行检测，经过固定、染色、漂洗、显影等步骤后，置于凝胶成像系统（BIO-RAD，USA）中拍照记录。

1.2.2 数据读取与分析 利用Image Lab 4.0软件读取凝胶影像条带，获得原始基因型结果，并运用DataTrans 2.0软件转换为基因型数据和“0”和“1”的矩阵。通过POPGENE 32软件和CERVUS软件计算遗传参数。利用NTSYS2.10和MEGA 5.1软件进行种质间和种源间的UPGMA聚类分析,应用NTSYS2.10软件和GenAlEx 6.502软件计算种质间遗传距离和地理距离，并进行Mantel检验。利用ClusterProject软件构建种质的指纹图谱。

2 结果与分析

2.1 SSR位点多态性分析

利用101对引物对61份东北杏种质进行扩增，结果见表1。101个SSR位点的平均观测等位基因为9.6436，有效等位基因比例在55.13%。等位基因数目存在差异，最多的有23个（位点Y109、P21），最少的有4个（位点X3H、X9H、X19H、X128、L62、Y44、Y48），且Na≥10有38对引物，Na≥15有16对引物，Na≥20有5对引物。不同位点的PIC变化范围在0.5030～0.9250之间，平均值为0.7316，其中，PIC值最高的位点为P58H（0.9250），PIC值最低的位点为Y50（0.5030），各位点PIC值均高于0.5。61份东北杏种质的平均Shannon信息指数高达1.7533，而平均观测杂合度（0.2155）低于平均期望杂合度（0.7711）。

表1 东北杏101个位点遗传多样性参数Table 1 Genetic diversity parameters of 101 loci in Armeniaca mandshurica

续表

2.2 不同种源东北杏群体遗传多样性分析

供试东北杏种质的10个种源遗传多样性参数见表2。平均Shannon信息指数为0.7431，平均观测等位基因2.8307，有效等位基因占比为78.63%，平均观测杂合度（0.2113）低于平均期望杂合度（0.4678）。辽宁省沈阳市的东北杏遗传多样性最为丰富，各项指标均为10个种源中的最大值（Na=5.0891，Ne=3.2249，I=1.2006，Ho=0.2353，He=0.6164），而辽宁省丹东市的遗传多样性水平最低。综合各遗传多样性参数，10个种源的东北杏遗传多样性差异较大，其多样性水平依次为：辽宁省沈阳市＞吉林省吉林市＞辽宁省抚顺市＞黑龙江省哈尔滨市＞吉林省延边州＞黑龙江省牡丹江市＞辽宁省本溪市＞黑龙江省鸡西市＞吉林省白山市＞辽宁省丹东市。

表2 东北杏10个种源遗传多样性参数Table 2 Genetic diversity parameters of 10 provenances of Armeniaca mandshurica

2.3 聚类分析

2.3.1 东北杏种质聚类分析 利用101个SSR位点数据分析东北杏种质的遗传相似性，结果表明，遗传相似系数平均值为0.8361，数值范围在0.7482～0.9410。其中，704号和705号东北杏种质遗传相似度最高（94.10%），均来自于辽宁省本溪市，说明二者之间的亲缘关系较近；而来自黑龙江省牡丹江市的774号和来自辽宁省沈阳市的725号东北杏种质遗传相似度最低（74.82%），说明二者之间的亲缘关系较远。

聚类分析结果见图2，遗传相似系数0.842处可将所有种质分为A、B、C、D共4类。A类、B类的东北杏种质来源均为辽宁省，其中，716号、717号、718号、719号、720号5个来自沈阳市的种质与辽宁省其他市的种质聚为A类，共20份种质；沈阳市内其他种质单独聚为B类，共12份种质；C类的东北杏种质来源均为吉林省，共17份种质；D类的东北杏种质来源均为黑龙江省，共12份种质。

图2 基于SSR标记的东北杏UPGMA树状图Figure 2 UPGMA dendritic map of Armeniaca mandshurica based on SSR markers

A类在遗传相似系数0.860处分成3个亚类。A1亚类共12个种质，包括丹东市种质、本溪市种质和抚顺市种质（710号、711号、712号）；A2亚类共4个种质，包括抚顺市种质（713号、714号、715号）与沈阳市的716号种质；A3亚类共4个种质，均来自沈阳市。

B类在遗传相似系数0.844处可进一步分为两个亚类，721号、722号、723号、724号、725号5个种质聚为B1亚类；726号、732号、727号、728号、729号、730号、731号7个种质聚为B2亚类。

C类在遗传相似系数0.864处分为3个亚类。C1亚类共10个种质，上支白山市种质与吉林市种质（744号、745号、746号）聚到一处，下支来自延边朝鲜族自治州的748号、749号、750号种质与吉林市种质（747号）聚到一处；C2亚类共5个种质，延边朝鲜族自治州的751号、752号、753号种质与来自吉林市的755号、756号种质聚到一处；C3亚类包括吉林市的757号和758号种质。

D类在遗传相似系数在0.862处划分为3个亚类。D1亚类共4个种质，均来自黑龙江省牡丹江市；D2亚类共4个种质，包括鸡西市种质和哈尔滨市种质（776号）；D3亚类共4个种质，均为哈尔滨市种质。

2.3.2 东北杏种源聚类分析 基于10个种源间的遗传距离矩阵做聚类分析，结果如图3。在遗传距离0.25处，可将其分为3类（P1、P2、P3），体现了地理种源的分布特点。P1类包括辽宁省的4个种源，其中，丹东市和本溪市亲缘关系最近，然后与沈阳市、抚顺市聚为一类；P2类包括吉林省的3个种源，延边朝鲜族自治州与吉林市亲缘关系最近，后与白山市聚为一类；P3类包括黑龙江省的3个种源，牡丹江市、鸡西市的亲缘关系略近于哈尔滨市。

图3 基于UPGMA法的东北杏种源聚类图Figure 3 UPGMA dendrogram for provenances of Armeniaca mandshurica

2.4 地理距离与遗传距离的相关性

聚类结果与东北杏种源高度吻合，经计算东北杏种质间的遗传距离变化范围为0.279～4.762，地理距离变化范围为0.002～755.333km，Mantel检验二者的相关性，结果见图4。线性回归方程为y=0.0035x+0.7606（R=0.752，p=0.010），说明东北杏种质的地理距离与遗传距离之间存在显著的相关性。

图4 东北杏种质间遗传距离与地理距离间的相关性Figure 4 Correlation between genetic distance and geographic distance in Armeniaca mandshurica germplasms

2.5 东北杏SSR指纹图谱构建

按照PIC＞0.9的原则，从101对引物中筛选出8对引物，结合基因型数据、经NTSYS2.10软件聚类分析验证，挑选出P58H（0.925）、L46（0.916）、L28H（0.903）3对引物。每对引物的区分能力不同，其中多态性最高的P58H引物仅能区分22份种质，P58H和L46两对引物组合能够区分57份种质，P58H、L46、L28H能区分全部的61份种质，具体引物信息见表3。利用3对引物对61份东北杏种质构建的SSR指纹图谱见图5。

表3 3对SSR引物信息Table 3 The information of 3 pairs of SSR primer

图5 61份东北杏种质的SSR指纹图谱Figure 5 SSR fingerprint of 61 Armeniaca mandshurica germplasms

3 讨论与结论

每个等位基因相当于一个具有不同重复单位拷贝数的DNA分子，位点的等位基因个数越多，意味着群体内的基因型的数目越多[23]。本研究基于SSR分子标记技术对61份东北杏种质的遗传多样性进行分析，观测等位基因（Na）平均值为9.6436。有效等位基因（Ne）反映了群体的变异程度，等位基因在群体中分布越均匀，Ne越接近Na值[24]。东北杏群体中Ne占比为55.13%，说明等位基因分布不均匀且存在稀有等位基因。101个位点的平均观测杂合度（Ho=0.2155）低于平均期望杂合度（He=0.7711），说明东北杏群体的杂合度不足，普遍存在近交衰退现象。Shannon信息指数（I）的平均值为1.7533，多态信息含量（PIC）的平均值为0.7316，变化范围在0.5030～0.9250之间，说明101个位点均为高度多态位点[25]。结合蔷薇科树种相关统计数据，认为同属内东北杏的遗传多样性丰富度低于新疆野杏[13]、普通杏[12]，高于西伯利亚杏[14]、梅[15]；与同科树种相比，东北杏的遗传多样性丰富度低于山荆子[Malusbaccata(L.)Borkh.][26]，高于长柄扁桃（AmygdaluspedunculataPall.）[27]、西藏光核桃（Amygdalusmira）[28]、山樱花[Cerasusserrulata(Lindley)Loudon][29]。

供试东北杏种源之间遗传多样性差异显著，说明东北杏的遗传基础丰富，但分布不均匀，以沈阳市东北杏种质的遗传多样性最为丰富（Na=5.0891，Ne=3.2249，I=1.2006，Ho=0.2353，He=0.6164）。此外，各种源杂合度普遍较低，且观测杂合度（0.1832～0.2353）低于期望杂合度（0.2878～0.6164），说明东北杏的近交衰退现象存在于各种源内部，该结果为制定中国东北杏野生资源合理的保育策略提供了重要参考。

本研究供试的61份种质来自10个不同种源，基本覆盖东北杏的自然地理分布区域，具有一定代表性。在遗传相似系数为0.842处可将东北杏种质分为4类，辽宁省内种质大多聚为A类，仅沈阳市部分种质聚为B类；吉林省内种质聚为C类；黑龙江省内种质聚为D类。对于东北杏的不同种源而言，在遗传距离0.25处，可分为P1辽宁省种源、P2吉林省种源、P3黑龙江省种源3类。聚类结果表明，同一种源内的种质或者来自不同种源但地理距离较近的种质存在较近的亲缘关系。

地理隔离(IBD，isolation by distance)是指配子（如花粉）的扩散因受到地理距离的限制而出现遗传分化[30-31]。基于有限的基因交流而产生显著的遗传差异，表现为随地理距离增加，遗传相似度随之下降的现象[32]。通过Mantel检验能够进一步确定遗传距离与地理距离之间是否存在线性相关性[33]。本研究中，地理距离与遗传距离存在显著的线性相关性（y=0.0035x+0.7606，R=0.752，p=0.010），表明东北杏存在IBD现象。杏属植物中，西伯利亚杏[34]（R=0.453，p＜0.010）存在IBD现象；而普通杏[32]（p＞0.050）、野杏[13]（R=0.332，p=0.160）则不存在明显的IBD现象。野生种群的遗传变异模式复杂，本研究聚类结果中存在与地理隔离不一致的个别现象，如来自哈尔滨市的776号与相距较远的鸡西市种质聚为D2亚类，可见地理隔离不是影响东北杏种内遗传分化的唯一因素。以植物景观遗传学的角度，环境因子的空间分异、地形起伏、生境梯度都有可能影响植物内部的遗传分化[35]，可做进一步研究调查，为东北杏种质的遗传多样性保护提供依据。

SSR指纹图谱在植物上最直接的应用，就是品种鉴定以及对品种质量和纯度的检测[36]。传统林木鉴别以形态系统分类法为主，而种内不同种源、家系、无性系、品种间以及近缘种则从形态上较难区别，利用SSR指纹图谱检测到的一些在分子水平上的微小变异，能够实现遗传鉴别[37]。本研究利用SSR位点的PIC值和基因型数据，筛选出3对引物（L46、P58H、L28H）构建SSR指纹图谱，将东北杏的部分遗传信息图像化，能够完全区分61份东北杏种质，还能对未知种源的东北杏种质进行种源鉴定。目前，普通杏[38]、西伯利亚杏[39]、梅[15]等杏属植物均已构建了SSR指纹图谱，东北杏SSR指纹图谱的补充，为杏属植物的分类鉴定和保护利用提供了有力支撑。

本研究开展了基于SSR标记的东北杏种质的遗传多样性及其指纹图谱构建的研究，结果表明，东北杏具有丰富的遗传多样性，辽宁省沈阳市的遗传多样性最高；地理种源对东北杏的分类结果占据主导地位，地理距离与遗传距离呈显著相关，东北杏存在地理隔离现象；利用3对引物构建了61份东北杏的SSR指纹图谱，为东北杏种质资源的鉴定评价、保育研究及合理开发利用提供了科学依据。