鲤科鱼类RNase 1基因的进化与组织表达模式

刘宁，陈秀荔，黄欣

1.华中农业大学水产学院/农业农村部淡水生物繁殖重点实验室，武汉 430070;2.广西壮族自治区水产科学研究院，南宁 530021

核糖核酸酶(RNase A)是一类在脊椎动物中存在的核酸水解酶。很多研究表明该基因家族的几个成员具有明显的消化、水解RNA、抗菌及抗病毒的作用[1-4]。胰核糖核酸酶(RNase 1)属于RNase A超家族，具有RNase A超家族的结构特征，其蛋白序列包含1个内含子和2个外显子，在第2个外显子上具有完整的CDS(coding sequence)区[5]，包含6～8个半胱氨酸形成的2个二硫键，具有特有的“CKXXNTF”氨基酸序列。有关RNase 1在哺乳动物中研究很多，例如人类(Homosapiens)[6]、牛(Bostaurus)[7]及叶猴(Pygathrixnemaeus)[8]等，特别是在其基因进化以及生物学功能研究方向。RNase1基因在哺乳动物中普遍存在基因拷贝，叶猴通过基因复制产生的RNase1B具有与小肠一致的较低pH环境，是其对植食性的一种适应[8]。Yu等[9]发现食肉目鼬科(Mustelidae)RNase1出现基因复制，推测与它们的进食快又多的特点相适应。啮齿类和食肉类动物肠道中缺少帮助消化的微生物，消化结构简单，却广泛表现出RNase1基因拷贝现象，促使研究者们去探讨RNase1基因重复所产生的新功能[10-12]。随着对高等脊椎动物RNase1基因分子进化机制及食性适应性进化研究的深入，低等脊椎动物RNase1基因研究也在不断开展。

关于鱼类RNase 1的研究较少，目前仅在斑马鱼(Daniorerio)[13]、大西洋鲑(Salmosalar)[14]和团头鲂(Megalobramaamblycephala)[15-16]等有报道。鲤科鱼类是我国分布最广、种类最多的淡水经济鱼类，它们的食性广泛且存在差异。故本研究通过对基因组中不同食性鲤科鱼类的RNase1基因进行序列和进化分析，进一步探讨不同鲤科鱼类RNase1基因结构及基因表达水平的差异，研究鱼类RNase 1结构和功能的关系，同时在不同食性鱼类之间阐释RNase 1的系统进化关系，旨在为进一步研究鱼类RNase1基因提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

成年草鱼(Ctenopharyngodonidella)、翘嘴鲌(Culteralburnus)、鳙(Hypophthalmichthysnobilis)和团头鲂来自华中农业大学鄂州水产实验基地。试验用鱼在实验室暂养2周，暂养期间保证溶氧充足，水温合适。样品采集前用氨基甲酸乙酯对鱼体进行麻醉，75%的乙醇消毒，在冰上采集团头鲂、草鱼、鳙和翘嘴鲌的肌肉、肝脏、脾脏、性腺、心脏、肾脏、肠、脑、鳃和血液10种组织迅速放入冻存管，置于液氮罐，之后转入-80 ℃冰箱备用。

1.2 鲤科鱼类RNase 1基因的鉴定及序列特征分析

在NCBI数据库中下载青鳉(Oryziaslatipes)、斑马鱼、虹鳟(Oncorhynchusmykiss)等RNase1基因序列作为比对序列，在团头鲂、草鱼、鲤(Cyprinuscarpio)、鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙及翘嘴鲌的全基因组数据库中比对分析，鉴定出7种鱼类的RNase1基因序列。鳡(Elopichthysbambusa)及黄尾鲴(Xenocyprisdavidi)的RNase1基因序列由笔者所在实验室前期克隆保存。对9种鲤科鱼类的RNase 1蛋白序列进行序列分析，首先利用BioEdit软件进行初级序列分析和氨基酸、核苷酸序列比对，然后在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez)上BLAST检测氨基酸序列的相似性。使用在线软件pI/Mw(http://web.expasy.org/compute_pi)测定RNase 1蛋白质等电点及分子质量等基本物理化学性质。用在线软件SignalP 4.1对RNase 1进行编码信号肽序列的预测。用SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)同源建模的方法对9种鲤科鱼类RNase 1的三级结构进行预测，之后利用PyMOL软件对鲤科鱼类RNase 1的三级结构进行可视化。

1.3 鲤科鱼类RNase 1的系统进化分析

为分析硬骨鱼类和哺乳动物RNase 1的进化关系，在NCBI数据库分别下载陆生哺乳动物、水生哺乳动物RNase 1序列，大西洋鲑(Salmosalar)和虹鳟(Oncorhynchusmykiss)的RNase1基因序列从Cho等[13]的研究中获得，将上述序列与本研究鉴定的9种鲤科鱼类的RNase 1序列采用CLC Sequence Viewer 6软件进行多序列比对，利用MEGA 5.0[17]使用最大似然法(ML)和最大简约法(MP)，重复检测 1 000次，构建系统发育树。

1.4 鲤科鱼类RNase 1基因表达分析

用TRIZOL裂解法提取团头鲂、鳙、翘嘴鲌和草鱼的心脏、脑、肾、肌肉、鳃、血液、脾脏、性腺、肠和肝脏的总RNA。然后用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，并使用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Scientific，美国)测量浓度。利用PrimeScript RT reagent KIT(TaKaRa，日本)试剂盒将每种鱼类不同组织总RNA转录成cDNA。采用PRIMER 5.0根据CDS区设计qRT-PCR引物(表1)。qRT-PCR反应使用Light Cycler 480(Roche，瑞士)，以β-actin作为内参基因。qRT-PCR条件为95 ℃预变性45 s；95 ℃模板变性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，进行35个循环，最后绘制熔解曲线。基因表达定量采用ΔΔCt 相对定量法计算。

表1 RNase 1基因的引物序列信息 Table 1 Primer sequence ofRNase 1 genes

2 结果与分析

2.1 鲤科鱼类RNase 1的同源性和理化性质

经过数据库搜索比对、鉴定与注释，最终获得9种鱼的完整RNase1基因序列。鲤科鱼类基因组中只存在1个RNase1基因。利用Bio-Edit软件对9种鱼RNase 1序列同源性进行分析比对，结果显示9种鲤科鱼类的RNase 1氨基酸序列相似度较高(图1A)，其中鲢与其他鱼类相似度范围最高(0.686～0.992)，鲤与其他鱼类的RNase 1氨基酸序列的相似度最低(0.594～0.695)。对RNase 1蛋白质的等电点、分子质量等基本物理化学性质分析发现，9种鲤科鱼类RNase 1蛋白质序列的物理化学特征非常相似，等电点在8.85～9.24、分子质量在14.46～14.90 ku；9种鲤科鱼类带正电的残留总数为18～21个(图1B)。

Cc：鲤 Cyprinus carpio； Xd：黄尾鲴 Xenocypris davidi； Hn：鳙 Hypophthalmichthys nobilis； Hm：鲢 Hypophthalmichthys molitrix； Ci：草鱼 Ctenopharyngodon idella； Ma：团头鲂 Megalobrama amblycephala； Eb：鳡 Elopichthys bambusa； Ca：翘嘴鲌 Culter alburnus； Dr：斑马鱼 Danio rerio； pI：等电点 Isoelectric point； Mw：分子质量 Molecular weight； K No.：赖氨酸的数量 Number of Lys； R No.：精氨酸的数量 Number of Arg； Total：带正电的残留总数(赖氨酸和精氨酸) Total number of positively charged residues (Lys+Arg).

2.2 鲤科鱼类RNase 1氨基酸多序列比对及三级结构预测

多序列比对结果显示，鲤科鱼类的氨基酸数均在150个左右，具有RNase A超家族的结构特征：N端有由20多个氨基酸组成的信号肽序列、His-Lys-His催化三联体结构、6个保守的半胱氨酸残基及“CKXXNTF” motif序列(图2A)。利用Swiss-Model在线软件对其三级结构进行同源建模，发现这9种鲤科鱼类RNase 1的三级结构非常相似，均由3个α螺旋、6个β折叠形成的二级结构和6个Loop区域组成，保守位点分布在α螺旋和β折叠上(图2B)。

2.3 RNase 1的系统发育分析

为了更好地了解不同脊椎动物RNase 1的进化关系，构建哺乳动物和硬骨鱼基于RNase 1蛋白质序列系统发育树如图3、图4所示：哺乳动物、啮齿动物及硬骨鱼RNase 1明显分为不同的进化支。大多数啮齿动物和陆生哺乳动物的RNase1基因都存在多拷贝，这是基因复制的结果，然而海洋哺乳动物及硬骨鱼的RNase1基因均为单拷贝(图3A、图4A)。鲤科鱼类RNase 1的MP与ML进化树显示，团头鲂与翘嘴鲌聚为一支，这与物种进化关系相符；MP进化树显示鳡与黄尾鲴聚为一支(图3B、图4B)。

图3 哺乳动物和鱼类RNase 1(A)与9种鲤科鱼类的RNase 1(B)的ML的系统发育进化树Fig.3 ML phylogenetic trees of RNase 1 in mammals and fishes(A) and nine of cyprinid fish(B)

图4 哺乳动物和鱼类RNase 1(A)与9种鲤科鱼类的RNase 1(B)的MP的系统发育进化树Fig.4 MP phylogenetic trees of RNase 1 in mammals and fishes(A) and nine of cyprinid fish(B)

6个半胱氨酸(活动-位点残基)用蓝色圆圈标记，3个催化残基用红色三角形显示；3个α螺旋(α1-α3)和6个β转角(β1-β6)分别用红色和黄色表示。The six structural cysteines (active-site residues) are marked with blue circle and three catalytic residues showed with red triangles. Locations of three α-helices (α1-α3) and six β-turns (β1-β6) are shown in red and yellow.

2.4 鲤科鱼RNase 1基因的组织表达模式

选取植食性的团头鲂和草鱼、杂食性的鳙和肉食性的翘嘴鲌进行不同食性鱼类RNase1基因在不同组织中的表达模式的研究。qRT-PCR结果显示(图5)，RNase1基因在4种鱼不同组织中的表达模式各不相同，其中在肝脏组织中的相对表达量高，差异达到极显著水平(P<0.01)。除肝脏外，团头鲂RNase1基因在鳃和肾脏中也高表达，差异极显著(P<0.01)，在心脏、血液、脾脏和性腺中也有表达(图5A)；翘嘴鲌的RNase1基因只在肝脏和脾脏中高表达(P<0.01)，其他组织中均不表达(图5B)；在鳙中，RNase1基因主要在肝脏和血液中表达，差异极显著(P<0.01)，在其他组织中均不表达(图5C)。与团头鲂不同的是，草鱼RNase1只在肝脏中高表达，在其他组织中均不表达(图5D)。

A:团头鲂 M. amblycephala； B:翘嘴鲌 C. alburnus； C:鳙 H. nobilis； D:草鱼 C. Idella. M:肌肉 Muscle; H:心脏 Heart； B:脑 Brain； K ：肾 Kidney； G ：鳃 Gill； D： 血液 Blood； S：脾脏 Spleen； O：性腺 Gonad；I：肠 Intestine；L:肝脏 Liver.

3 讨 论

本研究发现，硬骨鱼与哺乳动物的RNase 1分为不同的进化支。在哺乳动物进化支中，大多数RNase1基因存在多个拷贝，特别是在草食性的叶猴和牛身上，然而鱼类进化支上RNase1均为单拷贝基因，没有发生复制，这表明RNase1基因复制是对其消化生理的一种适应[18]。鱼类的RNase1基因在基因组中为单拷贝，一方面说明鱼类RNase1进化过程中比较保守，另一方面说明RNase1在低等脊椎动物中适应性分化为特定功能。此外，不同食性鲤科鱼类的RNase1进化显示，相同食性的鱼类并未聚类在一起，从进化角度说明鲤科鱼类的RNase 1的进化与物种食性的关联性不大，但符合物种进化的规律。

本研究中，9种不同食性的鲤科鱼类RNase 1带正电的氨基酸比例高。研究者们发现在哺乳动物中，具有抗菌作用的RNase1具有较高的等电点[19-20]。Cho等[13]对斑马鱼RNase 1重组蛋白功能的研究发现，RNase 1蛋白具有较强的消化活性和抗菌功能，斑马鱼的RNase 1重组蛋白的等电点不高，但与鸡一样，带正电的氨基酸比例很高。笔者所在实验室前期对团头鲂RNase 1重组蛋白的研究也得出同样的结论[21]。因此根据进化保守性，推测其在鲤科鱼类中可能普遍具有抗菌功能。

目前对于RNase 1的生物学功能假设都集中于消化活性上。我们对RNase1在不同食性鱼类的不同组织中表达模式进行研究，结果显示不同食性的鱼类表达模式存在差异，同种食性鱼类相同组织的表达情况也不同。根据相对定量结果，不同食性鲤科鱼类的RNase1基因在肝脏中的相对表达量均高。以往研究表明鱼类的食性与其自身消化器官的构造及内源性消化酶的消化机能密切相关[22]。鱼类肝胰脏分泌内源性消化酶，是鱼类重要的消化腺。而Cho等[13]的研究发现，在斑马鱼的成鱼阶段RNase1基因主要在肝脏和肠道中表达，其重组蛋白RNase 1的活性显示出较强的抗菌功能，消化活性不强。在大西洋鲑中曾有报道，RNase的抗菌功能与消化活性之间没有必然关系，它们互不影响，彼此独立[23]。因此，4种鲤科鱼类肝脏中高表达，其他组织中不表达或低表达，可能与斑马鱼一致，主要是在能量代谢方面发挥作用，是否具有消化活性，需要在今后的试验中进行进一步基因功能验证；同种食性的草鱼和团头鲂在其他组织的表达存在显著差异，表明RNase 1在同食性的鱼类中可能具有不同的功能，故从基因表达水平也推测RNase1基因进化与其物种本身的食性相关性不大。在翘嘴鲌和团头鲂中，RNase1基因在脾脏中表达量较高，推测RNase 1可能与其免疫机能相关。RNase1基因在鳙血液中高表达，推测其可能参与了系统稳态调节过程，特别是血管稳态的调节。综上所述，RNase1基因在不同组织中的表达模式各不相同，它们具体行使怎样的生物学功能，还需要在进一步的试验中进行深入探究。