无创单基因病的研究进展

胡听听 综述王继成 校审

（广州医科大学附属广东省妇儿医院，广东广州 510010）

1997 年，Lo等［1］证实了母体外周血胎儿游离DNA（cell-freefetal DNA，cff-DNA）可以诊断胎儿遗传性疾病。最近的临床研究也证实，在单胎妊娠中使用无创产前检测（non-invasive prenatal testing，NIPT）检测21、18、13-三体比传统的筛查方案具有更低的假阳性和更高的阳性预测值［2］。随后，各种方法如雨后春笋一样不断出现。如今，可以在母体外周血中发现全部的胎儿基因组［3，4］，这也是各种胎儿遗传性疾病可以通过母体外周血检测的基础。

产前诊断是通过各种方法检测和监测胎儿生长发育状况，检测方法分为有创和无创。传统有创产前检测方法是在血清学检查或超声诊断中发现胎儿可能存在生长发育异常状况，进一步对胎儿染色体进行检测，包括羊水穿刺、绒毛穿刺、脐血穿刺等胎儿细胞学检查。这些穿刺检测方法不仅会造成大约1%的流产率，也会对胎儿和母体造成伤害［5］。有研究发现，在孕5周时，孕妇外周血就可以稳定地检测到cff-DNA［6］，这样可以在早期即可监测胎儿遗传发育状态。通过提早检测胎儿遗传性疾病，可以尽早进行终止妊娠，避免对孕妇产生更多伤害。有研究表明，cff-DNA主要来源于胎盘滋养层细胞，高度片段化，在胎儿出生后就从母血中完全清除了，一般不会影响下一胎的检测［7］。

现阶段应用于临床的无创产前诊断主要是检测胎儿21、18、13和性染色体异常以及血型RHD基因的检测［2］。随着胎儿全基因组游离DNA的发现，单基因病检测成为下一个需要解决的难题。由于孕妇外周血中存在大量孕妇游离DNA，cff-DNA大约只占10%～15%［8］，对单基因的检测造成干扰，且需要获取父母或先证者的基因型构建胎儿基因型，从而推测胎儿单基因病遗传状况，所以现阶段无创产前单基因病检测还处于实验探索阶段。经过多年的技术和研究方法的改进，无创产前单基因病检测取得了长足的发展，本综述即以此发展作为主题，论述近几年单基因无创产前诊断的发展状况。

1 无创单基因病

单基因病又名孟德尔遗传病，从OMIM数据库（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov／omim）可查的单基因病大约有8000多种，平均每个人携带2.8个隐性遗传病致病突变。在无创产前胎儿单基因病检测中，由于需要先证者和父母双方的基因型，对于没有临床表型并且没有先证者的家庭，或者对于难以发现的隐性单基因遗传病的家庭，进行无创产前单基因检测很困难。随着技术的发展和方法学的改进，很多胎儿的遗传病现在都可以通过各种方法检测出，包括常染色体显性、隐性遗传病，比如α／β地中海贫血、遗传性肾上腺增生、软骨发育不全、囊性纤维化等。单基因遗传特点见表1。

表1 单基因病遗传特点

外周血中90%是母体DNA［4］，通过检测母体外周血中胎儿新发突变和父方突变，可以间接获取胎儿单基因病携带状况。但是暂时还没有一种方法能直接获得母体外周血中胎儿全部基因组DNA，故多数研究都停留在试验阶段。现有的技术或方法都旨在提高母血中cff-DNA的检测质量，提高疾病检测的灵敏度和特异度。这些方法包括基本的分子生物学检测技术和新发展的下代测序技术或单分子测序技术等，对于不同的疾病需使用不同的方法。而临床应用则需要检测方法操作简单、结果可靠、检测时间短，以及检测费用低廉。

3 常见无创单基因病检测方法和技术

母血血浆中胎儿DNA浓度非常低，且大多属于小片段（大多数是小于200bp）［8］，需要合适的提取方法和分析方法检测胎儿DNA。常见的提取方法有磁珠提取法和柱提法。柱提法有QIAamp DNA Blood Mini Kit或者TIANamp Micro DNA Kit等，常用的检测技术方法见表2。

表2 常用检测技术和方法

这些方法（见表2）中测序技术包括一代sanger测序，比如ABI3500测序平台；二代循环芯片测序法（cyclic-array sequencing），比如Roche454、Illumina Miseq、Ion Torrent等测序平台；三代测序单分子测序，比如Heliscope等测序平台。通过这些技术方法获得的数据进行生物学分析，可以得到胎儿的遗传学信息。分析方法主要有直接检测法，比如检测Y染色体异常突变；相对突变剂量法（relative mutation dosage，RMD），通过检测血浆DNA中相对突变剂量进行突变位点分析，主要针对常染色体显性遗传病，比如血友病、Rh D基因检测；相对单体剂量法（relative haplotype dosage analysis，RHDO），多用于单基因病的检测，主要使用单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）连锁分析获得胎儿的单体型，从而推测胎儿的等位基因突变点。Lo等［3］在一篇文章中提到，在单体型等位基因检测方面RHDO优于RMD，并且分析方法也更为准确可靠。RHDO方法主要从下面几个方面检测出胎儿遗传单体型等位基因：首先通过对父母双方和先证者进行SNP位点检测，获得所需的SNP位点信息，然后进行外周血cff-DNA检测，再通过RHDO分析计算cff-DNA等位SNP位点比率，推测出胎儿遗传自父母的单体型。若检测遗传自父方单体型，则选取父方为杂合母方为纯合的SNP位点构建胎儿单体型；检测母方遗传的胎儿单体型，则需要选取母方为杂合父方为纯合的SNP位点，再通过相对剂量计算就可以得出胎儿单体型。这种方法选取的SNP位点越多得到的结果也就越可靠准确，但也需要平衡检测费用等。

RHDO存在的问题是如何获得cff-DNA所占母体游离DNA的比例。由于个体差异，cff-DNA的量易受孕妇孕周、体重等影响，不容易确定。对于男婴可以通过Y染色体确定cff-DNA比例，比如选取Y染色体上的SRY基因进行荧光定量PCR。然而对于女婴，由于很难选取与母体差异的标志基因，故很难进行定量。一种方法是经过大规模人群筛选，确定160bp的片段大多来源于胎儿DNA，故通过测定该片段的量可以确定cff-DNA的量；另一种方法是选取母体和胎儿差异表达的基因进行相对定量。一项研究发现RASSF1A基因在母体中是低甲基化的，而在胎盘中是高甲基化的，通过限制酶对低表达的母血DNA消化，然后对胎儿特异的RASSF1A高甲基化基因进行荧光定量PCR测定，则可确定cff-DNA的量［9，10］。Lam等［11］在无创产前诊断beta地中海贫血研究中使用6号染色体上的父母均为纯合的SNP位点获得胎儿cff-DNA所占比例，该方法的方程式为f＝∑2p／∑（p＋q）（其中p是父方遗传的cff-DNA数量，q是母方和母方遗传的cff-DNA数量，f是cff-DNA所占比例）。

一项由Hui和Lo等［12］参与的研究证实通过RHDO方法可以检测大多数单基因病。他们使用10Xgenomic公司的Linked read技术，结合二代测序，对13个家庭进行RHDO分析，包括Beta地中海贫血、先天性肾上腺皮质增生症和血友病。该研究团队先对13个家庭的父母单倍型进行分析，确定所需的的SNP位点，然后通过测序检测母血中短片段游离DNA，通过RHDO分析胎儿突变图谱，确定胎儿单基因病遗传突变情况。由于该方法成本高，暂不适用于临床。

4 常见单基因病的无创产前检测（表3）

表3 常见单基因病的无创检测

4.1 杜氏肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）和贝氏肌营养不良（Beckermuscular dystrophy，BMD） DMD是一种X-连锁隐性遗传性肌病，典型临床特征以进行性肌萎缩无力伴小腿腓肠肌假性肥大为主。在人群中一般3～5岁发病，20岁左右便发病死亡，在存活的男婴中其发病率为1／3600～1／6000［27］。BMD发病率略低，大概1／18 000，具有DMD相似的临床特征，但病情较轻。DMD基因至少含有79个外显子，位于Xp21.2，长度大约为2.4Mb。约70%DMD患者存在1个或多个外显子大片段缺失或重复，剩余约30%可能是点突变、小的插入缺失、复杂的微小重排等。Xu等［13］的1项对8个家庭的研究提出无创产前诊断可以应用于检测DMD。这8个家庭的孕妇都是DMD携带者，孕期分布为17～22周，他们首先通过目标测序检测出父方、母方和先证者的单体型，选取SNP位点进行探针设计。这些探针在X染色体上随机分布，包括1.66M的外显子区域和39 319个高度杂合的SNP位点，其中1243个SNP位点是在DMD基因区域。cff-DNA浓度通过选取父母SNP为纯合的位点，22号染色体为杂合的SNP位点进行检测，浓度差别大概在3.52%～22.67%之间。外周血游离DNA使用Illumina Hiseq2000检测，目标区域测序深度为36.4，覆盖度为95.23%，然后通过隐马尔科夫模型隐马尔可夫模型（hidden Markov model，HMM）推测胎儿单体型。该方法得出的结果和有创绒毛膜穿刺结果一致，但由于检测费用高，易受游离胎儿DNA浓度和胎儿染色体重组的影响，故暂时还未进入临床应用。

英国伯明翰妇女医院遗传实验室Michael团队招募了2个研究组对无创产前检测DMD进行研究，一组是已经通过有创检测出非整倍体高风险孕妇，另一组是已知孕妇是DMD／BMD携带者［28］。由于DMD／BMD是X连锁遗传病，所以只需要通过母亲单体型和先证者单体型确定SNP位点进行检测分析。对孕妇外周血游离DNA进行目标捕获测序检测后，通过RHDO分析，获得胎儿单体型。目标探针检测区域包括1350个SNP位点，位于该基因的2.4Mb范围内（Chr X：31037731-33457670）。结果显示除了2个家庭游离DNA过低（低于4%）无法做进一步检测，其他结果都和有创检测结果一致。同时该团队提到需要设计更多的探针检测基因上下游非编码区，因为这些调控区域也可能导致疾病的发生。最后他们谈到可以建立探针数据库和通过检测多种疾病完善方法来降低检测费用。

4.2 脊髓性肌萎缩不良（spinal muscular atrophy，SMA） SMA是一种常染色体隐性遗传疾病，发病率约为1／6000～1／10 000。这种病在2岁以下小孩致死率很高，给家庭带来巨大痛苦和负担。约95%的病人主要由于SMN1基因中的7、8号外显子缺失。传统的产前诊断方法是通过绒毛或羊水穿刺获取胎儿DNA，使用多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）、QF-PCR、DHPLC等方法检测。2015年Chen［29］团队的一项研究表明可以通过无创方法检测胎儿SMA基因突变。该研究团队招募了5个SMA携带者家庭，使用目标捕获测序法对SMN1基因的28Kb编码序列和该基因上下3M区域的2011个SNP位点进行测序，然后通过父母、先证者三方的SNP位点进行分析，最后的结果和侵入性产前诊断的结果完全一致。该研究证明该方法的可靠性较高，但受测序深度、SNP位点信息和目标区域GC含量的影响，导致该方法敏感性低。

Parks［17］的团队使用目标捕获测序法合并RHDO方法从父方、母方和先证者的SNP连锁分析的到胎儿单体型，检测胎儿SMA。他们选取了位于5号染色体13.2区域的包括SMA1和SMA2基因的6Mb区域共3039个SNP位点，这些位点杂合率大于40%。检测分析了13个家系，灵敏度和特异度为100%，单体型SNP分型的准确度为99.43%。该方法的缺点为无法检测嵌合的家系、新发突变、异卵双胞胎、器官移植和没有先证者的家系。若使用该方法对双胎消失之一的孕妇和SMA基因高度重复序列重组难以设计探针的区域的家系进行检测，可能会导致误诊。该方法可以在孕初期进行检测，而不影响后续的妊娠监测。

4.3 地中海贫血 地中海贫血是遗传突变导致珠蛋白合成障碍或缺乏的一种血液疾病，表现为小细胞低色素贫血，严重者需要终生输血，甚至胎死宫内。针对地中海贫血，现有的产前检测手段为绒毛检测、羊水穿刺或脐血穿刺，这可能会导致胎儿畸形、死亡或宫内感染。Lam等［11］使用了目标捕获测序结合RHDO分析检测β地中海贫血，对每个家庭都需要重新设计SNP位点，但如若父母有亲缘关系则很难选择SNP位点。该研究对于已知点突变且容易直接从孕妇外周血游离DNA获取突变型，则可以使用RMD，这样根据不同的情况选择这两种方法，更经济有效。南方医科大学的Yan等［15］在2011年发表的文章中指出，可以对α0型地中海贫血（--SEA、--FIL和--THAI）缺失部位寻找SNP位点，排除父方遗传的α0型，可以使一半的孕妇免受有创检测。常见的β地中海贫血大多都是HBB基因点突变引起的，α地中海贫血大多由相关基因缺失引起。桂林医科大学附属医院的优生遗传实验室尝试通过孕妇外周血cff-DNA来检测α和β地中海贫血，这给地中海贫血携带者孕妇带来希望［15］。他们使用的是目标捕获测序结合RHDO分析，捕获探针包含3.7Mb的目标区域，包括HBA1、HBA2和HBB基因突变区域。首先通过目标捕获测序检测父母和先证者的单体型，然后测序母体外周血游离DNA，分析其单体型组成，推测胎儿单体型，最后获得胎儿遗传突变位点。他们招募了2个家庭进行研究，一个家庭是CD17（A＞T）的母亲和CD41-42（-TTCT）的父亲，另一个家庭夫妻双方都是SEA杂合缺失。该研究和之前的无创产前检测地中海贫血的新颖点在于他们使用了目标区域高度杂合的SNP位点，这样减少了目标区域的范围，进而减少了测序深度，降低了成本，同时区域限制在小范围可以减少重组导致的误差。

4.4 囊性纤维化 囊性纤维化是一种严重的常染色体隐性遗传病，由于外分泌腺异常导致慢性梗阻性肺病、消化系统疾病等，患有该病的半数儿童因感染或心肺衰竭等严重并发症导致死亡。在活婴中发病率为1／2500～1／3500，携带率大约为1／25。Hill［22］的研究团队招募了囊性纤维化基因CFTR突变携带者的孕妇，首先建立一个CFTR突变基因相关的二代测序Panel，通过测序方法检测CFTR基因附近的多个SNP位点，然后使用RMD分析胎儿基因型。这种方法可以同时检测不同的家庭、不同的突变点和一些其他的不同的情况。和全基因组测序、目标捕获测序等方法相比这种方法具有实效性、时间短、花费少。他们同时还提出在确保准确、安全、有效的情况下，应该站在孕妇角度，从实用和经济角度考虑，这些研究才更有意义。另一项研究针对具有囊性纤维化或SMA高风险的63个孕妇家庭，进行多种方法组合检测［26］。他们首先从孕妇外周血细胞中有核细胞进行HE染色，分离大于15um的滋养层细胞，进行全基因组扩增，然后使用短串联重复序列（short tandem repeat，STR）方法检测胎儿遗传突变。该方法比起其他检测cff-DNA更为直接，实验若设计合理则可以的到可靠的结果，这也给未来无创产前筛查（non-invasive prenatal scanning，NIPS）带来一个新的发展方向。

5 结语

通过方法和策略的选择，我们已经能够检测很多的已知的单基因遗传病。虽然母体外周血中cff-DNA浓度很低，但检测灵敏度不断提高，4%左右的cff-DNA浓度已经能应用到胎儿遗传病的检测。从cff-DNA的发现，到非整倍体检测的成熟，到现在胎儿基因组学、表观遗传学、转录组学等各方面开花。通过基因组学，我们不仅可以知晓胎儿非整倍体情况，也可以获取胎儿微缺失／微重复的状况［30］；通过表观遗传学，我们可以追踪胎儿生长发育状况，甚至通过对胎儿疾病早期干预，达到治疗的目的［31］；通过转录组学，可以更加深刻地认识表达调控等信息［32］。随着非整倍体在临床中的大规模应用，将会有越来越多的遗传性疾病在无创产前诊断中应用，相信随着研究的深入，对胎儿疾病的干预治疗等也会随着胎儿遗传物质的研究而发展。但是面对基因重组、嵌合体、双胎妊娠等还没有一个好的解决方案；对于新发突变，需要不断地改进方法。另一方面，单基因病只占全部遗传性疾病的少部分，应用于临床则需要考虑费用，现今的NIPS检测方法大多费时费力费钱，也需要不断改进。现阶段通过加大测序深度，大多数单基因病或新发突变都能通过适当分析得到，但这些方法和策略面对不同疾病类型就需要不断更换，不断重新设计，比如SNP位点的选择，使检测成本大幅提升。不过随着研究的方法深入，获得的信息越来越多，技术越来越成熟，测序成本越来越低，相信不久的将来无创产前单基因病也会成为一个临床常规项目。