以VEGFR为靶点的齐墩果酸衍生物合成及其抗肿瘤活性研究

丁明雪，邬月娇，梅 宇，孟艳秋

(沈阳化工大学 制药与生物工程学院， 辽宁 沈阳 110142)

齐墩果酸(oleanolic acid，OA)是一种五环三萜类化合物，主要以游离或组合糖苷的形式存在于各种植物中，包括青叶胆、孕牛漆、灌木胆等植物[1-2]，齐墩果酸衍生物具有多种药理活性，包括保肝抗炎、降血糖、抗病毒、抗肿瘤等[3-7].近年来，孟艳秋课题研究小组开展了齐墩果酸、积雪草酸、熊果酸等五环三萜类化合物的结构修饰及体外抗肿瘤活性评价，并且通过计算机辅助药物设计，在对化合物与蛋白靶点结合的模拟和分析方面取得了一定的进展[8-14].

靶向血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及其受体VEGFR的药物会降低血管内皮生长因子的表达，消耗肿瘤细胞产生的血管内皮生长因子，从而抑制肿瘤血管生成和抑制肿瘤生长.研究表明，OA可以抑制肿瘤细胞中VEGFR的表达，是其抗肿瘤作用的关键靶点[15].阿昔替尼(Axitinib)是由辉瑞公司开发的靶向VEGFR小分子酪氨酸激酶抑制剂，用于晚期肾细胞癌症患者[16-19].笔者利用计算机辅助药物设计研究了阿昔替尼与VEGFR目标蛋白(PDB编号：5ew3)之间的相互作用，由结果可知阿昔替尼结构中的胺基片段与VEGFR蛋白的氨基酸残基TYR1136形成氢键，并与目标蛋白形成强大的结合力，且胺基是抗肿瘤作用的重要药效团.笔者将孟艳秋研究小组提出的五环三萜化合物的结构修饰与参与临床研究的抗肿瘤化合物相结合，在齐墩果酸A环形成含氮杂环并将芳香胺活性基团引入到C-28 位，设计合成了5个衍生物 Ⅰ1～Ⅰ5.使用Glide软件对设计的化合物进行基于分子对接的虚拟筛选，结果显示VEGFR蛋白与化合物Ⅰ5的结合方式显示出较强的结合能力.

1 实验部分

1.1 目标化合物的合成路线

化合物的合成路线见图1.

a 丙酮，琼斯试剂，室温 b 草酰氯，芳香胺，吡啶，1，2-二氯乙烷，室温，4 h c 甲酸乙酯，叔丁醇钾，二氯甲烷，室温，10 h d 水合肼，无水乙醇，83 ℃回流4 h图1 目标化合物的合成路线Fig.1 Synthetic routes of the target compounds

1.2 目标化合物的合成

1.2.1 3-羰基-齐墩果烷型-12-烯-28-羧酸(OA-1) 的制备

取0.500 g OA(1.10 mmol)置于100 mL茄形瓶中，用50 mL丙酮将其充分溶解，在冰浴条件下滴加0.65 mL(5.78 mmol)琼斯试剂，25 min后转室温反应约2.5 h.滴加20 mL异丙醇淬灭45 min，减压蒸除溶剂，用饱和食盐水和乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，无水NaSO4干燥.粗制产品经硅胶柱色谱纯化得0.474 g白色固体OA-1，产率95.6%，mp 221.6～222.9 ℃.

1.2.2 3-羰基-齐墩果烷型-12-烯-28-酰-苯胺(OA-2) 的制备

取OA-1(0.500 g，1.10 mmol)放入100 mL茄形瓶中，加入25 mL干燥的1，2-二氯乙烷溶解，冰浴条件下滴加草酰氯(0.47 mL，1.20 mmol)，40 ℃加热并且回流，反应约4 h，减压蒸除溶剂，残余物用10 mL环已烷洗涤3次.取苯胺溶解到30 mL二氯甲烷中，滴加制备的酰氯，放入0.10 g 4-二甲氨基吡啶和0.5 mL吡啶，室温下反应12 h.加入15 mL饱和食盐水，用2 mol/L稀盐酸调节pH为3～4，分离有机层，饱和食盐水和二氯甲烷萃取3次，合并有机相，无水NaSO4干燥.粗制品经硅胶柱色谱纯化得0.359 g淡黄色晶体OA-2，产率67.3%，mp 123.6～126.7 ℃.

1.2.3 2-羟亚甲基-3-羰基-齐墩果烷型-12-烯-28-酰-苯胺(OA-3)的制备

取OA-2(0.400 g，0.8 mmol)放入100 mL茄形瓶中，加入15 mL无水甲苯溶解，冰浴条件下加入0.20 g叔丁醇钾，滴加1 mL甲酸乙酯，20 min后升为室温反应12 h.减压蒸除溶剂，得淡黄色油状固体，经稀盐酸洗涤，用饱和食盐水和乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，无水NaSO4干燥.粗品用硅胶柱色谱纯化得0.315 g淡黄色片状固体OA-3，产率78.8%，mp 196.2～197.5 ℃.

1.2.4 N-[吡唑-齐墩果烷型-12-烯-28-酰]-苯胺(Ⅰ1)的制备

取OA-3(0.300 g，0.8 mmol)放入100 mL茄形瓶中，溶于20 mL无水乙醇，滴加0.2 mL水合肼，83 ℃冷凝回流4 h.减压蒸除溶剂无水乙醇，再用乙酸乙酯和饱和食盐水萃取3次，合并有机相得到黄色澄明液体，减压蒸除溶剂乙酸乙酯，粗产物用硅胶柱色谱纯化得0.173 g淡黄色固体Ⅰ1，产率57.7%，mp 183.5～184.7 ℃.

1.2.5 N-[吡唑-齐墩果烷型-12-烯-28-酰]-对甲氧基苯胺(Ⅰ2)的制备

根据Ⅰ1的制备方法，由中间体OA-1(1.10 mmol)与对甲氧基苯胺(2.20 mmol)反应,最终粗产物用硅胶柱色谱纯化得0.186 g淡黄色粉末状固体Ⅰ2，产率62.0%，mp 189.5～190.7 ℃.

1.2.6 N-[吡唑-齐墩果烷型-12-烯-28-酰]-间氟苯胺(Ⅰ3)的制备

根据Ⅰ1的制备方法，由中间体OA-1(1.10 mmol)与间氟苯胺(2.20 mmol)反应,最终粗产物用硅胶柱色谱纯化得0.166 g淡黄色粉末状固体Ⅰ3，产率55.3%，mp 191.5～192.7 ℃.

1.2.7 N-[吡唑-齐墩果烷型-12-烯-28-酰]-对硝基苯胺(Ⅰ4)的制备

根据Ⅰ1的制备方法，由中间体OA-1(1.10 mmol)与对硝基苯胺(2.20 mmol)反应,最终粗产物用硅胶柱色谱纯化得0.156 g淡黄色粉末状固体Ⅰ4，产率52.0%，mp 187.6～188.9 ℃.

1.2.8 N-[吡唑-齐墩果烷型-12-烯-28-酰]-间氯苯胺(Ⅰ5)的制备

根据Ⅰ1的制备方法，由中间体OA-1(1.10 mmol)与间氯苯胺(2.20 mmol)反应,最终粗产物用硅胶柱色谱纯化得0.193 g淡黄色粉末状固体Ⅰ5，产率64.3%，mp 192.1～193.7 ℃.

2 分子对接

使用Glide软件(Maestro版11.5.011，MMshare版4.1.011、2018-1版)对设计的化合物进行基于分子对接的虚拟筛选.用VEGFR作为靶点(PDB编号：5ew3)，从http://www.rcsb.org/pdb下载.Protein Preparation Wizard模块用于蛋白结构的准备，例如添加氢，填充缺失的侧链和去除结合口袋中水分子等.Receptor Gride Generation模块用于生成受体格点文件.蛋白质结构中的共结晶配体确定结合位点的位置，以超高精度(XP)模式进行分子对接筛选，化合物Ⅰ1～Ⅰ5对接结果打分见表1.能量分数的绝对值越大，结合能力越强.由表1可以看出：化合物Ⅰ5与靶蛋白自身配体能量分数几乎一致，表现出与VEGFR有较强的结合能力，值得进一步研究.通过对比阿昔替尼和化合物Ⅰ5与靶蛋白的对接图(图2、图3) 发现阿昔替尼和化合物Ⅰ5与靶蛋白连有相同的疏水氨基酸残基(关键氨基酸：TYR1136、ARG1126、LEU1140、ARG1124)，且胺基片段均与TYR1136产生氢键作用，初步判断化合物Ⅰ5和阿昔替尼与靶蛋白具有相同的结合位点.

表1 不同化合物与VEGFR的能量得分比较Table 1 Comparison of energy scores between different compounds and VEGFR

图2 阿昔替尼与VEGFR活性位点的结合Fig.2 Binding of Axitinib to the active site of VEGFR

图3 化合物Ⅰ5与VEGFR活性位点的结合Fig.3 Binding of compound Ⅰ5 to the active site of VEGFR

3 结果与讨论

3.1 目标化合物的表征

设计合成的5个新型齐墩果酸衍生物的结构经MS、NMR确证，结果见表2、表3和表4.

表2 MS目标化合物数据Table 2 MS target compound data

表3 1H-NMR目标化合物数据Table 3 1H-NMR target compound data

表4 13C-NMR目标化合物数据Table 4 13C-NMR target compound data

3.2 初步体外活性测试

采用MTT比色法测试合成的化合物初步体外抗肿瘤活性.以吉非替尼和阿霉素为阳性对照，实验方法参见文献[20]，实验结果见表5.由表5可知:目标化合物对HepG2 和 MCF-7 细胞的生长均具有一定的抑制作用，目标化合物IC50值Ⅰ5>Ⅰ4>Ⅰ2>Ⅰ1>Ⅰ3.因此，OA在C-28位酰胺化结构修饰时化合物会有更好的活性，其化合物Ⅰ5值得进一步研究.

表5 目标化合物对HEPG2和MCF-7细胞增殖的抑制活性Table 5 Inhibitory activity of the target compounds on the HepG2 and MCF-7 cells proliferation

3.3 VEGFR受体抑制实验

采用荧光偏振免疫分析法，对通过计算机辅助设计模拟结合力较好且体外生物活性较好的化合物Ⅰ5进行VEGFR受体抑制活性测试，通过GraphPad Prism 5计算得Ⅰ5在10 mg/L时的IC50值为3.57 μmol/L，结果表明化合物Ⅰ5对VEGFR蛋白具有较好的抑制作用.

4 结 论

笔者以OA为起始原料，使用计算机辅助药物设计对接模拟，将含氮杂环引入A环并在C-28位形成酰胺，合成了5种新的齐墩果酸衍生物，其结构通过MS和NMR确证，且在人肝癌细胞(HepG2)和乳腺癌细胞(MCF-7)中均具有良好的生长抑制活性，其中化合物Ⅰ5对HepG2细胞的抑制率优于阳性对照物吉非替尼，说明齐墩果酸A环引入吡唑环具有更好的抗肿瘤活性.VEGFR受体蛋白抑制实验表明化合物Ⅰ5对VEGFR受体表现出较强的抑制活性.该研究结果对进一步优化设计齐墩果酸衍生物作为VEGFR受体抑制剂的研究具有一定的指导意义，为研发高效低毒的抗肿瘤药物奠定良好的理论基础.