DNA倍体定量分析在宫颈上皮内瘤变及癌变细胞学筛查中的意义

陈 威,谭敏华,周泳健,黄文彦,李 玲,安建虹,申 洪

(1.肇庆市第一人民医院 病理科,肇庆 526060;2.华南理工大学医学院,广州 510060;3.南方医科大学 基础医学院病理学系,广州 510515)

0 引言

宫颈癌与HPV(human papilloma virus, HPV)感染关系密切[1]。从感染HPV到宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)及癌变伴随宫颈上皮细胞DNA倍体改变。因此,DNA倍体改变可反映CIN及癌变[2]。目前,CIN及癌变的筛查主要采用宫颈细胞学涂片巴氏染色和液基细胞学检测，DNA倍体检测在筛查中的价值尚存争议[3]，是否值得采用DNA倍体分析方法进行宫颈癌和宫颈上皮内瘤变的细胞学筛查及细胞学诊断，尚需科学分析和评价。为此，本文对宫颈脱落细胞DNA倍体检测方法在CIN及癌变筛查中的应用价值进行了诊断试验评价，为临床应用时的选择提供参考。为避免样本构成因素对诊断试验评价结果中的准确度、阳性预告值和阴性预告值的影响，本文增加了新的评价指标(包括标准化准确度(SAc，standardized accuracy)、标准化阳性预告值(SPPV，standardized positive predictive value)和标准化阴性预告值(SNPV，standardized negative predictive value)进行评价。

1 材料与方法

1.1 病例

源自肇庆市第一人民医院,2018年3月至2020年3月期间行宫颈脱落细胞DNA倍体定量分析的10 766例病例。按照诊断试验评价设计要求,从中筛选出同时进行了病理活检诊断的病例，共1113例。年龄19～77岁，平均年龄42.1±10.3岁。

1.2 研究方法

1.2.1 标本采集与处理

由妇科医师采集受检者宫颈脱落细胞，连同采样刷头一同置于盛有保存液的标本瓶中，病理科制备液基薄层涂片。

1.2.2 DNA倍体定量检测分析

对上述液基薄层细胞涂片行Feulgen染色，用全自动DNA倍体分析系统(武汉呵尔医疗科技发展有限公司)定量测试涂片内所有细胞核的DNA倍体[4]。判读标准如下：当DNA指数(DI，DNA index)<2.5，定义为异倍体阴性，记作：DNA异倍体(-)，即涂片中异倍体细胞=0个；当DI≥2.5，定义为异倍体阳性，记作：DNA异倍体(+)，即涂片中异倍体细胞≥1个，其中当异倍体细胞为1～2个时，记作：异倍体(1+)；当异倍体细胞≥3个时，记作：异倍体(2+)。

1.2.3 诊断金标准及分组

妇产科医生对异倍体(+)的病例行阴道镜检查并在宫颈可疑病变部位行4个以上组织位点的活检。本研究异倍体(+)或(-)并行宫颈病理活检诊断的病例分别为863和250例，合计1113例。

根据活检结果，宫颈病变被分为CIN阴性(宫颈普通慢性炎症)、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和癌变。为了表述简捷，本文用“CIN”泛指CINⅠ-Ⅲ，用“CINⅠ及以上”泛指CINⅠ-Ⅲ及癌变，用“CINⅡ及以上”泛指CINⅡ-Ⅲ及癌变，用“CIN及以下”泛指CINⅠ-Ⅲ及CIN阴性，以此类推。

1.2.4 统计学方法

以病理活检诊断为金标准，按照诊断试验评价方法(表1)[4-5]，分别计算异倍体(+)，包括了(1+)和(2+)，以及单独(2+)时对筛查CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和癌的灵敏度(Se，sensitivity)、特异度(Sp，specificity)、准确度(Ac，accuracy)、标化准确度(SAc)、阳性预告值(PPV，positive predictive value)、标化阳性预告值(SPPV)、阴性预告值(NPV，negative predictive value)和标化阴性预告值(SNPV)[5-8]，具体计算公式如表1 所示。

表1 诊断试验分析评价模式

(1)

(2)

(3)

SAc=(Se+Sp)/2

(4)

(5)

(6)

(7)

(8)

2 结果

2.1 1113例患者宫颈细胞DNA倍体测试与宫颈活检病理诊断基本结果

①宫颈DNA异倍体(+，图1a)并行病理活检共863例，其中CINⅠ(图1b)127例，CINⅡ(图1c)和Ⅲ(图1d)229例，癌21例(包括鳞癌19例，图1e；腺癌2例，图1f)，CIN阴性486例；②异倍体(2+)并活检395例，其中CINⅠ78例，CINⅡ和Ⅲ共208例，癌19例，病理活检CIN阴性90例；③DNA异倍体(-)并活检250例，其中CINⅠ16例，CINⅡ和Ⅲ共2例，病理活检CIN阴性232例。具体检测结果如表2所示。

图1 DNA倍体异常及其对应活检阳性病例图示a.DNA异倍体(+)，Feulgen染色示细胞核增大，染色质增粗，呈紫蓝色；b.CINⅠ，鳞状上皮层内1/3不典型增生，并见挖空细胞；c.CINⅡ，不典型增生细胞超过鳞状上皮内1/3，未超过内2/3；d.CINⅢ，不典型增生细胞累及鳞状上皮全层；e.宫颈鳞状细胞癌(中分化)，异型鳞状上皮突破上皮，呈浸润性生长；f.宫颈腺癌(高分化)，异型腺上皮呈不规则腺样，浸润性生长。放大倍数及染色：图a、d为物镜40×; b、c、e、f为物镜20×；b、c、d、e和f为HE染色。

表2 宫颈细胞DNA倍体定量测试结果与宫颈活检病理检查结果

2.2 基于异倍体(+)筛查CIN及癌变的诊断试验评价结果

以异倍体(+)为标准，包括(1+)和(2+)，筛查CIN及癌变，异倍体(+)病例中活检诊断CIN及癌变共377例，阴性486例；异倍体(-)病例中活检诊断CIN及癌变18例，阴性232例。筛查的Se、Sp、Ac、SAc、PPV、SPPV、NPV和SNPV分别为：95.4%、32.3%、54.7%、63.9%、43.7%、58.5%、92.8%和87.5%，如表3所示。

表3 基于异倍体(+)筛查CIN及癌变的诊断试验评价结果

2.3 基于异倍体(+)筛查CINⅡ、Ⅲ及癌变的诊断试验评价结果

以异倍体(+)为标准，包括(1+)和(2+)，筛查CINⅡ、Ⅲ及癌变，异倍体(+)病例中活检诊断CINⅡ、Ⅲ及癌变共250例，CINⅠ及阴性共613例；异倍体(-)病例中活检诊断CINⅡ和Ⅲ 2例，CINⅠ及阴性共248例。筛查的Se、Sp、Ac、SAc、PPV、SPPV、NPV和SNPV分别为：99.2%、28.8%、44.7%、64.0%、29.0%、58.2%、99.2%和97.3%，如表4所示。

表4 基于异倍体(+)筛查CINⅡ及以上病变(包括癌变)的诊断试验评价结果

2.4 基于异倍体(+)筛查宫颈癌的诊断试验评价结果

以异倍体(+)为标准，包括(1+)和(2+)，筛查宫颈癌，异倍体(+)病例中活检诊断鳞癌共21例，CINⅠ-Ⅲ及阴性842例；异倍体(-)病例中癌0例，CINⅠ-Ⅲ及阴性250例。筛查的Se、Sp、Ac、SAc、PPV、SPPV、NPV和SNPV分别为:100%、22.9%、24.3%、61.5%、2.4%、56.5%、100%和100%，如表5所示。

表5 基于异倍体(+)筛查宫颈癌的诊断试验评价

2.5 基于异倍体(2+)筛查CIN和癌变的诊断试验评价结果

以异倍体(2+)为标准筛查CIN和癌变，异倍体(2+)病例中活检诊断CIN和癌变共305例，阴性90例；异倍体(1+)及(-)病例中诊断CIN和癌变共90例，阴性628例。筛查的Se、Sp、Ac、SAc、PPV、SPPV、NPV和SNPV分别为：77.2%、87.5%、83.8%、82.4%、77.2%、86.1%、87.5%和79.3%，如表6所示。

表6 基于异倍体(2+)筛查CIN和癌变的诊断试验评价结果

2.6 基于异倍体(2+)筛查CINⅡ、Ⅲ及癌变的诊断试验评价结果

以异倍体(2+)为标准筛查CINⅡ、Ⅲ及癌变，异倍体(2+)病例中活检诊断CINⅡ、Ⅲ及癌变227例，CINⅠ及以下病变168例；异倍体(1+)及(-)病例中诊断CINⅡ、Ⅲ及癌变25例，CINⅠ及以下病变693例。筛查的Se、Sp、Ac、SAc、PPV、SPPV、NPV和SNPV分别为:90.1%、80.5%、82.7%、85.3%、57.5%、82.2%、96.5%和89.0%，如表7所示。

表7 基于异倍体(2+)筛查CINⅡ、Ⅲ及癌变的诊断试验评价结果

2.7 基于异倍体(2+)筛查宫颈癌的诊断试验评价结果

以异倍体(2+)为标准筛查宫颈癌，异倍体(2+)病例中活检诊断宫颈癌共19例，CINⅢ及以下病变(包括阴性)共376例；异倍体(1+)及(-)的病例中诊断宫颈癌2例，CINⅢ及以下病变共716例。筛查的Se、Sp、Ac、SAc、PPV、SPPV、NPV和SNPV分别为：90.5%、65.5%、66%、78.1%、4.8%、72.5%、99.7%和87.4%，如表8所示。

表8 基于异倍体(2+)筛查宫颈鳞癌的诊断试验评价

表9为异倍体筛查CIN及宫颈癌诊断试验评价汇总结果，可见异倍体(+)筛查CIN及宫颈癌的灵敏度高达95%～100%，不易漏诊；标化阴性预告值高达88%～100%；筛查效果优于单纯异倍体(2+)。单纯异倍体(2+)筛查的特异性为66%～88%，标化准确性为78%～85%，优于异倍体(+)，但灵敏度较异倍体(+)低，漏诊约10%～18%。

表9 异倍体筛查CIN及宫颈癌的诊断试验评价结果比较

3 讨论

正常人体体细胞DNA含量是稳定的2倍体，并存在少量的整倍体。发生肿瘤时，瘤细胞核内染色体异常和DNA含量改变，形成异倍体和非整倍体，并先于细胞形态改变。因此，DNA异倍体与肿瘤细胞增殖有密切关系，成为肿瘤病理学研究中的重要分析内容。

DNA倍体定量分析系统(AcCell)在20世纪50年代由加拿大不列颠哥伦比亚省肿瘤研究所研发并逐步应用于宫颈癌筛查，具有测试结果快速、客观、准确且重复性好等特点[9]。由于DNA倍体定量分析受标本取材、制片、细胞数差异、细胞重叠及测试仪器参数设置不同等因素的影响[10-12]，其检测意义还存在不同的认识。2001年孙小蓉等引进该项技术进行的大量宫颈癌筛查研究表明，细胞DNA定量分析方法在宫颈癌的早期发现方面有重要价值[4]。

本研究结果表明：①以异倍体(+)为标准，包括(1+)和(2+)，对宫颈上皮内瘤变和宫颈癌、高级别上皮内瘤变和宫颈癌、以及单纯宫颈癌筛查的灵敏度高分别为95.4%、99.2%和100%，标准化准确度分别为63.9%、64%和61.5%，标准化阳性预告值分别为58.5%、58.2%和56.5%，标准化阴性预告值分别为87.5%、97.3%和100%，筛查的灵敏度和标准化阴性预告值高，其中筛查宫颈癌的灵敏度可达100%，虽然没有漏诊发生，但特异度和标准化阳性预告值较低。②以异倍体(2+)为标准对宫颈上皮内瘤变和宫颈癌、高级别上皮内瘤变和宫颈癌、以及单纯宫颈癌筛查的灵敏度分别为77.2%、90.1%和90.5%，特异度分别为87.5%、80.5%和65.5%，标化准确度分别为82.4%、85.3%和78.1%，标化阳性预告值分别为86.1%、82.2%和72.5%，标化阴性预告值分别为79.3%、89.0%和87.4%，筛查的灵敏度和标化阴性预告制较异倍体(+)这一筛查标准有所降低，但特异度、标化准确度和标化阴性预告值明显提高，各项指标均优于单纯以异倍体(1+)为标准的筛查结果。③在异倍体(+)和异倍体(2+)筛查标准中，筛查的灵敏度与病变程度呈正相关，上皮内瘤变癌变级别越高，筛查的灵敏度越高，漏诊率越低，即DNA倍体分析能有效筛查宫颈癌和宫颈高级别上皮内瘤变。

由于通常诊断试验评价中的准确度、阳性预告值和阴性预告值评价指标受不同组别样本构成不同因素的影响，表观评价值有可能而产生假象。采用标准化准确度、标准化阳性预告值和标准化阴性预告值评价指标可避免表观数据因不同组别样本构成不同而产生的假象，从而科学衡量和评价诊断试验的准确度、阳性预告值和阴性预告值[5-8]。为此，本研究在诊断试验评价中，对准确度、阳性预告值和阴性预告值3项评价指标进行了标化，补充了标化准确度、标化阳性预告值和标化阴性预告值3项评价指标，使得这3项评价指标的结果不受样本构成不同的影响。

有关研究指出[13-14]，放疗和激素水平紊乱可影响机体细胞，出现异倍体，降低DNA倍体定量分析的特异性。因此，在用DNA倍体定量分析进行宫颈癌筛查时，应注意放疗和激素水平紊乱的影响，通过进一步活检，排除假阳性筛查结果。

综上，当异倍体(+)，筛查CIN、CINII+III及宫颈癌的灵敏度高，分别为95.4%、99.2%和100%，标准化阴性预告值分别高达87.5%、97.3%和100%，但特异度低，标准化准确度为61%～64%，标准化阳性预告值为56.5%～58.5%。因此，DNA倍体分析能有效筛查宫颈癌和宫颈高级别上皮内瘤变，不易漏整，但确诊能力低，对于筛查阳性病例须进一步活检确诊。以确诊而不是筛查为目的的宫颈上皮内瘤变和宫颈癌的细胞学检查，则不宜采用宫颈细胞学DNA倍体分析检查，以单纯异倍体(2+)为阈值，筛查CINⅡ、Ⅲ及癌可明显提高筛查的特异度和准确性度，但灵敏度降低，易出现漏诊。以异倍体(+)筛查CINⅡ、Ⅲ及癌的灵敏度高，特异度和准确度较高。

本研究得到肇庆市科技创新指导类项目(201904031417)和广州市科技计划项目(201300000192)资助，特此致谢！