γ射线照射对肺泡上皮细胞生物学行为的影响及机制初探

张 潇，叶雨萌，李 杨

(1. 军事科学院 军事医学研究院 辐射医学研究所，北京 100036;2. 郑州大学 医学科学院，郑州 450000)

0 引言

近年来胸部恶性肿瘤的发病率居高不下，放疗是其主要治疗手段之一，导致的放射性肺损伤(radiation induced lung injury, RILI)是常见且限制放疗剂量甚至应用的并发症之一，不仅降低肿瘤局部控制率,更严重损害患者的生活质量,进展至后期往往可危及生命。肺泡上皮细胞(alverlar epithelial cell, AEC)是肺组织RILI的主要靶细胞。RILI过程中细胞凋亡起重要的作用，实质细胞(AEC等)的过度凋亡，会导致RILI的发生，最终导致肺纤维化[1]。DNA是电离辐射(ionizing radiation, IR)的作用靶点，细胞凋亡为DNA损伤的主要结局之一。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)是DNA损伤后修复、细胞凋亡和细胞坏死性死亡的“转换点”，三氨基苯甲酰胺(3-Aminobenzamide, 3-AB)是PARP特异的抑制剂[2]。本研究通过离体培养肺泡上皮细胞A549，采用60Co γ射线照射，在照射后的不同时间点，应用噻唑蓝(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yi)-2,5- diphnytetrazolium bromide, MTT)法、丫啶橙(acridine orange, AO)/嗅化乙锭(ethidium bromide, EB)染色法、磷酸化组蛋白H2AX(phosphorylated H2AX, γ H2AX )的免疫荧光染色等方法检测细胞增殖活力、细胞凋亡、DNA损伤、AIF和PARP等的表达；并应用抑制剂3-AB作用于细胞，采用γ射线照射，免疫印迹检测AIF的表达。旨在研究γ射线照射对肺泡上皮细胞生物学行为的影响并初步探讨其机制。

1 材料和方法

1.1 实验用细胞及处理

采用A549肺泡上皮细胞。将A549细胞按照1×104个/mL接种到培养瓶中，在37℃、5% CO2培养箱中培养，24 h后进行照射，或加入抑制剂3-AB并设对照组，浓度分别为5 mM、10 mM和20 mM，处理24 h后进行照射。

1.2 细胞照射

采用60Co γ射线照射，单次照射，剂量为5 Gy，剂量率99.34 Gy/min。分别在照射后不同时间点进行各项检测。

1.3 MTT比色法检测细胞增殖活力

照射后30 min、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h及72 h检测细胞增殖活力。将细胞按照1×104个/mL接种于96孔板，次日每孔加入20 μL MTT工作液。4 h后每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min后用多功能酶标仪将波长设置为490 nm检测OD值。

1.4 AO/EB染色法检测细胞凋亡

将A549细胞按照1×104个/mL接种到六孔板中24 h进行照射，于照射后30 min、1 h、3 h、6 h、12 h检测A594细胞凋亡情况。将AO、EB溶液制备为工作液，将细胞照射后细胞制成爬片并移入到加有AO/EB的培养皿中染色2 min，后将爬片倒扣至洁净的载玻片上。采用荧光显微镜观察且拍照。将各种类型的细胞进行计数，并计算出凋亡细胞率。

1.5 γ H2A检测DNA损伤

照射后30 min、1 h、3 h、6 h、12 h检测A549细胞DNA损伤。将照射后A549细胞制成爬片。将0.05%胰蛋白酶滴在爬片上15 min，后0.01 mol/1 PBS溶液洗3次。采用10%山羊血清封闭30 min，37℃。滴加γ H2AX(1∶500)滴加在爬片上，4℃ 过夜。后滴加1∶100的荧光二抗，在37℃避光孵育1 h。采用DAPI封片，后采用DM3000B荧光显微镜拍照，并计算阳性细胞比例。

1.6 免疫印迹法检测细胞中AIF的表达

首先提取细胞总蛋白。在A549细胞中加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，每107个细胞需要1 mL。超声能充分细胞裂解，放在冰上30 min，4℃离心后取上清液，即为细胞蛋白。采用12%分离胶和5%的浓缩胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，将凝胶中的蛋白转印于聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride, PVDF)上，在5%脱脂奶粉的TBST液中封闭1 h，再与一抗(1∶1000)4℃孵育过夜。用TBST洗3次，每次10 min，将其与辣根过氧化物酶欧联的山羊抗兔IgG抗体室温孵育1 h，用TBST洗3次，每次10 min，最后用ECL显色。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 γ射线照射对A549细胞增殖活力的影响

5 Gy γ射线照射A549细胞后3 h、6 h、12 h和72 h，A549细胞增殖活力均较照射前显著降低，照射后24 h和48 h，细胞增殖活力较照射前均无差异(图1)。

图1 5 Gy γ射线照射后不同时间A549细胞增殖活力的变化

2.2 γ射线照射可致A549细胞DNA损伤

5 Gy γ射线照射后30 min、1 h、3 h，与对照组比较，可见较多DNA受损细胞；照射后6 h、12 h γ H2AX焦点阳性细胞减少，但仍显著多于照射前(图2A, 2B)。γ射线照射后A549细胞出现DNA损伤的阳性细胞百分比,如图3所示。

图2 5 Gy γ射线照射对A549细胞DNA损伤的影响(γ H2AX 的免疫荧光染色、scale bar=20 μm)A：对照组细胞;B：5 Gy照射组

图3 5 Gy γ射线照射对A549细胞DNA损伤阳性细胞百分比

2.3 γ射线照射对A549细胞凋亡的影响

5 Gy γ射线照射后30 min，可见少量凋亡细胞，与对照组无显著差异，照射后1 h和 3 h，凋亡的细胞数较对照组显著增多，尤以照射后3 h最为显著，照射后6 h凋亡细胞数目较3h明显减少，但仍多于照射后30 min，照射后12 h，凋亡细胞数目显著减少与对照组无显著差异(图4、图5)。

图4 5 Gy γ射线照射对A549细胞凋亡的影响(scale bar=20 μm)

图5 5 Gy γ射线照射对A549细胞凋亡细胞百分比

2.4 γ射线照射后A549细胞PARP的表达变化

5 Gy γ射线照射后30 min、3 h和12 h，A549细胞的PARP表达较照射前低，尤其以照射后12 h表达降低最为显著；照射后1 h和6 h，PARP表达较照射前高，以照射后6 h表达增高更为显著(图6)。

图6 5 Gy γ射线照射后A549细胞全长PARP的表达变化

5 Gy γ射线照射后除24 h外的几个时间点，A549细胞的切割后PARP表达较照射前高，尤其以照射后30 min表达升高最为显著；照射后24 h，切割后的PARP表达较照射前低(图7)。

图7 5 Gy γ射线照射后A549细胞切割后PARP的表达变化

2.5 抑制剂3-AB对照射后A549细胞AIF表达的影响

5 Gy γ射线照射后各时间点 A549细胞AIF的表达均高于照射前，尤以照射后3 h表达增高最为显著。3-AB处理的A549细胞经5 Gy γ射线照射后，除1 h外各时间点AIF表达均显著低于单纯5 Gy γ射线照射组，尤以照射后3 h差异最为显著(图8)。

图8 抑制剂3-AB处理后A549细胞经γ射线照射后PARP的表达变化

3 讨论

RILI主要包括早期的急性放射性肺炎和晚期的放射性肺纤维化[1]。肺炎经有效治疗可恢复，一旦形成放射性肺纤维化，则无法逆转。随着放疗技术的不断发展，RILI的发生率有所下降，但仍大于15%[3]。近年来，RILI机制在细胞因子及其信号转导通路、miRNA及其他非编码RNA、粘附因子及免疫失调等多方面进行了深入的研究，取得了一定得进展，但许多问题又亟待解决。因此，进一步研究RILI机制，对于发现新的防治靶点具有重要的理论和实际意义。

射线照射可致DNA损伤，DNA损伤有多种类型，其中严重的损伤是DNA双链断裂(DNA double-strand breaks, DSBs)，若不能得到及时准确的修复，将会引起细胞凋亡，影响基因组稳定性，导致染色体缺失及重排，致肿瘤及与年龄相关的疾病的发生[4]。Rogakou等[5]于1998年首先发现经IR及药物处理细胞后，可引起 DNA双链断裂，从而引起的丝氨酸-谷氨酰胺-谷氨酸结构域中的丝氨酸残基迅速磷酸化，并将磷酸化的H2AX命名为γ H2AX。研究表明，γ H2AX焦点的形成没有细胞特异性，并且无论何种因素诱导产生的DSBs都伴随有H2AX的磷酸化[6]。DSBs可诱导产生γ H2AX，而且γ H2AX和DSBs的量存在对应关系，因此,γ H2AX为经典的DSBs标志物。此外，Cande等[7]发现线粒体调节的凋亡通路可由线粒体膜释放AIF而介导完成，AIF具有促凋亡的作用，其表达升高为凋亡发生的标志之一。本文主要通过γ H2AX和AIF两个指标的检测及AO/EB染色观察AEC于γ射线照射后DNA损伤和凋亡的发生。

AEC是肺组织放射损伤的主要靶细胞，AEC凋亡是RILI发生、发展的重要始动和维持因素，AEC凋亡后，如果能正常修复，可恢复正常肺泡结构和功能，如果AEC持续发生凋亡，肺泡上皮结构破坏，将导致肺纤维化的发生，但RILI进展过程中AEC凋亡的机制尚未阐明。文献报道γ射线照射所致肺损伤模型中发现AEC的凋亡[8]。8 Gyγ射线照射离体培养的AEC，其凋亡率为(24.27±1.73)%[9]。本研究选用5 Gy γ射线照射，发现可抑制A549细胞增殖，导致A549细胞发生DNA损伤和凋亡，进而以PARP为初步探讨其机制。

PARP是DNA损伤后修复、细胞凋亡和细胞坏死性死亡的“转换点”，可以看作DNA损伤的感受器。有研究报道，小剂量电离辐射可致PARP活化，在DNA损伤修复中起到重要作用[10]。还有研究报道，由于PARP活性被损伤的DNA激活，PARP将ATP耗竭，引起细胞坏死[11]。提示PARP活性可被损伤的DNA激活，一方面参与DNA修复，抑制细胞凋亡；另一方面也可致细胞凋亡和坏死。3-AB是PARP的特异性的抑制剂，可通过抑制PARP活性，调节DNA损伤和修复[12]。AIF是定位于线粒体中的黄素蛋白，是非Caspase依赖凋亡途径的关键介质，在损伤部位，AIF从线粒体中释放并转移至细胞核，引起大规模DNA断裂和神经细胞凋亡[13-14]。PARP是引发 AIF 从线粒体释放并转移至细胞核的重要内在因素之一[15-16]。PAR介导AIF从线粒体易位到细胞核被认为是过度活化 PARP引起的细胞死亡的原因之一。PAR是一个 PARP以糖苷键连接形成的聚合物，主要在细胞核中产生定位于细胞质，在线粒体膜上与 AIF结合，引发 AIF解离和从线粒体释放，同时转位到细胞核，引发大规模 DNA断裂最终诱导细胞死亡[17-18]。本研究结果表明，γ射线照射可导致AIF、PARP和活化的PARP表达均升高，应用PARP特异性抑制剂3-AB显著抑制照射导致AEC的凋亡。上述结果提示，PARP对于辐射所导致的AEC凋亡可能具有正调控作用，尚有待进一步深入研究。