Ndfip1在APP/PS1转基因小鼠脑内表达变化及其对老年斑沉积的影响

张程锦，田 娟

(锦州医科大学 基础医学院，辽宁 锦州 121001)

0 引言

阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease, AD)属于神经退行性疾病，好发于老年人，主要表现为进行性认知功能障碍等症状。临床研究发现，该病患者脑内可出现淀粉样前体蛋白 (amyloid precursor protein, APP)的异常代谢以及Aβ (β-amyloid peptide)的沉积，最终形成老年斑 (senil plaque, SP)[1-2]。脑内Aβ异常增生、聚集和沉积对神经细胞具有损伤作用，可导致其坏死、功能丧失，这是诱发神经退行性疾病的重要原因之一[3-4]。有报道称，Ndfip1(Nedd4 family interacting protein 1)可通过泛素化降解途径，清除神经细胞中具有损伤作用的错误折叠的有害蛋白，减少神经细胞凋亡，对神经系统发挥保护作用[5]。国外学者发现，Ndfip1在大脑内广泛分布表达[6]。前期研究也发现，Ndfip1在大脑皮质、海马表达，且在老年斑内也有分布，提示Ndfip1可能参与Aβ的形成以及沉积过程。但两者的关系目前尚未见报道。本研究首先观察了APP/PS1转基因小鼠大脑皮质和海马Ndfip1分布和表达情况，以及Ndfip1与Aβ老年斑的共定位，由此推测Ndfip1参与阿尔茨海默症脑内老年斑的形成过程。其次，通过体外实验进一步检测Ndfip1过表达对APPsw细胞APP代谢及Aβ分泌量的影响，以明确Ndfip1对APP代谢及Aβ分泌的调控作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物培育、取材

48周龄雄性APP/PS1转基因小鼠购自美国Jackson 实验室。动物麻醉后处死，迅速取出脑组织，浸入4%多聚甲醛固定过夜；次日，将脑组织依次放入70%、80%、90%、95%、100%酒精逐级脱水后，再放入二甲苯直至组织变得半透明，随后将脑组织取出，放入液态石蜡中浸蜡处理，包埋成石蜡块后，切成厚度为7 μm的石蜡切片，捞片烘干后备用。

1.2 细胞培养

细胞系采用APPsw细胞(稳定转染人APP的SH-SY5Y细胞)。取冻存细胞置于38℃水中浴解冻，轻柔吸至含10 %胎牛血清的DMEM/F12培养液中，在培养箱中培养传代，培养条件为 37℃，5% CO2和100%湿度。细胞接种于12孔板，接种密度为 2×105/mL。细胞贴壁生长后换双无培养液(无血清无抗生素)继续培养至80%融合。

1.3 细胞转染

分别取1.5 μL LipofectamineTM2000和0.6 μg Ndfip1质粒，均用双无培养液稀释至75 μL，混匀后静置。取细胞清洗后加入300 μL双无培养液，逐滴加入转染混合液，放入培养箱6 h后，换常规培养液继续培养48 h。实验组为Ndfip1质粒转染的APPsw细胞；对照组为空质粒转染的APPsw细胞。

1.4 主要试剂

Ndfip1质粒(上海吉凯基因科技有限公司)，兔抗Ndfip1抗体、兔抗APP抗体(英国Abcam公司)，小鼠抗β-Amyloid抗体、DAPI、Texas Red(美国Santa Cruz公司)，FITC(美国Jackson实验室)，GAPDH单克隆抗体、辣根酶标记的羊抗兔IgG和辣根酶标记的羊抗鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)，Aβ1-42 ELISA试剂盒(上海晶抗)，LipofectamineTM2000转染试剂(美国Invitrogen公司)。

1.5 免疫荧光技术

石蜡切片常规进行脱蜡处理、水化。高压修复后，PBS缓冲液洗3次，每次5 min。5%驴血清封闭1 h；加入兔抗Ndfip1抗体(稀释比例1∶100)和小鼠抗β-Amyloid抗体(稀释比例1∶400)，在湿盒内4℃冰箱孵育过夜。PBS缓冲液洗3次，每次5 min。加入荧光二抗-Texas Red(红)和FITC(绿)，在避光湿盒内室温孵育1 h。PBS缓冲液洗3次，每次5 min。加入DAPI (蓝)复染核，PBS缓冲液洗3次，每次5 min。封片，荧光共聚焦显微镜观察，照相保存。

1.6 蛋白印迹技术

收集动物脑组织和细胞，加裂解液裂解后离心，取上清液进行蛋白定量，分装待用。配制分离胶和浓缩胶。将待检测蛋白与上样缓冲液混匀，沸水浴中加热5 min使蛋白变性，上样到加样孔内开始电泳，电压100 V，设定120 min，至溴酚蓝达胶底端停止电泳，转膜1 h，将膜放入脱脂奶粉溶液封闭1 h，加兔抗Ndfip1(稀释比例1∶200)抗体或兔抗APP(稀释比例1∶200)抗体4℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(稀释比例1∶2000)孵育2 h，检测蛋白条带，扫描后应用Photoshop 7.0软件处理，内参为GAPDH。

1.7 ELISA法

取细胞培养基，放入离心管内低温离心取上清液，-20℃保存待用。按说明书进行标准品的稀释与加样，稀释后各孔加样量为50 μL，浓度分别为1800 ng/L、1200 ng/L、600 ng/L、300 ng/L和150 ng/L。设空白孔(不加样品及酶标试剂)和待测样品孔(加样品稀释液40 μL和待测样品10 μL)。37℃温育30 min，弃去液体，甩干，加洗涤液洗30 s，重复5次，拍干。每孔加酶标试剂50 μL,37℃温育30 min，弃去液体，甩干，加洗涤液洗30 s，重复5次，拍干。加显色剂A 50 μL，显色剂B 50 μL，混匀，37℃避光显色15 min，加终止液50 μL，450 nm波长测量各孔吸光度。

1.8 统计分析

2 结果

2.1 Ndfip1在APP/PS1转基因小鼠大脑皮质和海马的分布与表达

免疫荧光三标共聚焦激光扫描结果显示，APP/PS1转基因小鼠大脑皮质可见Ndfip1阳性表达；海马内也可见Ndfip1阳性表达。Ndfip1分布于锥体神经细胞的核周质和突起内。在Aβ阳性老年斑中可见Ndfip与Aβ共定位表达(图1)。

图1 APP/PS1转基因小鼠脑内Ndfip1定位分布(免疫荧光染色，Scale bar = 100 μm)红色荧光：标记Ndfip1；绿色荧光：标记Aβ老年斑；蓝色荧光：DAPI标记细胞核，白色箭头和插入框显示神经元；黑色箭头指示老年斑

蛋白印迹结果显示，与对照组相比，Ndfip1蛋白在APP/PS1转基因小鼠大脑皮质的表达水平明显下调，结果有统计学意义(*P<0.05)，见图2。同样，Ndfip1蛋白在APP/PS1转基因小鼠大脑海马的表达水平也明显下调，结果有统计学意义(**P<0.01)，见图3。

图2 APP/PS1转基因小鼠大脑皮质Ndfip1蛋白表达变化(*P<0.05)A：电泳条带；B：柱状图；Con：对照组；APP/PS1：APP/PS1转基因小鼠组

图3 APP/PS1转基因小鼠大脑海马Ndfip1蛋白表达变化(** P<0.01)A：电泳条带；B：柱状图；Con：对照组；APP/PS1：APP/PS1转基因小鼠组

2.2 Ndfip1过表达对APPsw细胞APP代谢及Aβ分泌量的影响

蛋白印迹技术检测质粒转染48 h后，与对照组相比，实验组细胞内APP695表达量明显下调，结果有统计学意义(*P<0.05)，见图4。ELISA法检测2组细胞条件培养基中Aβ1-42的水平，发现实验组细胞分泌的Aβ1-42明显低于对照组，结果有统计学意义(*P<0.05)，见图5。

图4 Ndfip1过表达对APPsw细胞内APP695表达的影响 (*P<0.05)A：电泳条带；B：柱状图；pCMV-MCS：对照组即空质粒转染的APPsw细胞；pCMV-MCS-Ndfip1：实验组即Ndfip1质粒转染的APPsw细胞

图5 Ndfip1过表达对APPsw细胞分泌Aβ1-42水平的影响(* P<0.05)pCMV-MCS：对照组即空质粒转染的APPsw细胞；pCMV-MCS-Ndfip1：实验组即Ndfip1质粒转染的APPsw细胞

3 讨论

AD主要病理学标志是脑部出现老年斑，其核心成分是Aβ。正常情况下APP通过α-分泌酶途径降解形成可溶性的短链Aβ，但在AD早期APP的氨基端经β-分泌酶和γ-分泌酶异常水解产生不溶性的长链Aβ (主要是Aβ1-42) ，并在细胞外形成纤维状聚合体，其神经毒性可使周围的神经元变性死亡，最终形成以Aβ为核心，周围为变性神经元和神经胶质细胞的老年斑。

Ndfip1属于跨膜蛋白，它通过与Nedd4分子结构的WW部位特异性结合，协助Nedd4蛋白催化泛素分子，使泛素易于与靶蛋白结合，即靶蛋白发生泛素化。蛋白酶体能够识别并且降解泛素化的靶蛋白。这就是蛋白质的泛素化降解过程[7-9]。蛋白质泛素化降解过程在体内普遍存在，特别是蛋白在某些诱导因素作用下发生错误折叠的时候。

Ndfip1在大脑内广泛表达。国外有研究者发现，Ndfip1在成人大脑左右半球、丘脑、脑垂体中均有较高表达[6]。本研究前期通过免疫组织化学技术观察到，Ndfip1在小鼠大脑皮质和海马均有表达。在皮质，Ndfip1广泛分布；在海马，局限表达于CA3区。本研究通过免疫荧光共聚焦技术同样发现，在APP/PS1转基因小鼠大脑皮质和海马内均可见Ndfip1表达。大部分Ndfip1阳性表达位于锥体神经元的核周质和突起中。蛋白印迹结果显示，与对照组相比，Ndfip1蛋白在APP/PS1转基因小鼠大脑皮质和海马内的表达水平明显下调。提示Ndfip1可能参与阿尔茨海默症的病理过程。近年来，研究者对Ndfip1在细胞内定位也进行了深入的观察，应用免疫组织化学技术、亚细胞分离法和激光共聚焦扫描显微技术检测了内源性Ndfip1 蛋白的亚细胞定位，发现Ndfip1蛋白定位表达于高尔基复合体；且Ndfip1异位表达可导致高尔基复合体结构异常[10]。另有研究者通过细胞分级分离方法获得细胞的内质网，应用蛋白印迹技术检测到Ndfip1在内质网也有表达[11]。通过确定Ndfip1的亚细胞定位，学者们推测Ndfip1在蛋白质的转运、加工和修饰过程中发挥重要的作用。

Ndfip1对大脑神经细胞具有保护作用。Howitt等构建了Ndfip1慢病毒表达载体和Ndfip1 shRNA慢病毒表达载体，分别转染SH-SY5Y细胞和人原代培养皮质细胞并检测神经细胞的凋亡率，发现Ndfip1过表达降低了神经细胞的凋亡率[12]。本研究前期实验也证实这一观点[13-14]。在创伤性脑损伤发生立早期(2 h内)大脑皮层基因转录水平变化研究中，Sang等通过SAGE和实时定量PCR技术检测发现Ndfip1蛋白在外伤区域周围的残存神经细胞上有明显高表达，同时伴随其结合蛋白Nedd4 表达水平增加，推测两者的高表达及相互作用，可能有利于去除受损伤神经细胞中有害的错误折叠蛋白，促进神经细胞的存活[15]。本研究发现，在APP/PS1转基因小鼠大脑皮质和海马老年斑可见Ndfip1阳性表达，在其中心位置表达最为强烈，且与Aβ呈现部分共定位表达。提示Ndfip1可能参与Aβ沉积和老年斑形成过程。为了进一步明确Ndfip1对Aβ的调控作用，我们用Ndfip1质粒转染APPsw细胞使其过表达Ndfip1，随后检测细胞内APP695蛋白含量，以明确Ndfip1对APP代谢的影响；应用ELISA法检测细胞条件培养基中Aβ1-42的水平以明确Ndfip1对Aβ分泌的影响。结果显示，Ndfip1过表达可使APPsw细胞内APP695表达下调，分泌的Aβ1-42减少。表明Ndfip1过表达能够负性调控APP代谢过程，减少Aβ的分泌，减轻Aβ的沉积以及老年斑形成，减弱对神经细胞的损伤作用，缓解疾病的病理过程。Ndfip1对Aβ产生和沉积的具体调控机制还有待于进一步深入研究。随着Ndfip1参与阿尔茨海默症病理过程的调控机制不断揭示，将为该疾病的预防和治疗提供新的思路。