鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活苗(La Sota株+M41株+Re-9株)应用效果研究

洪素梅，袁月，刘月月，田辉，程艺，张盼涛，王林果，薛景景，刘武杰*，田克恭*

(1. 国家兽用药品工程技术研究中心，河南 洛阳 471000；2. 普莱柯生物工程股份有限公司，河南 洛阳 471000)

鸡新城疫是由新城疫病毒(NDV)引起的一种烈性传染性疾病，鸡群感染后会产生拉稀、精神沉郁、神经紊乱等症状[1]，死亡率高，危害严重，目前在全世界范围内流行。鸡传染性支气管炎是由传染性支气管炎病毒(IBV)引起的急性呼吸型传染性疾病，感染鸡常常表现为喷嚏、啰音、呼吸困难等，可造成肉鸡增重缓慢、料重比下降，蛋鸡产蛋下降、畸形蛋、沙壳蛋增多等[2]，给养禽业造成严重的经济损失。H9亚型禽流感是危害我国养禽业的重要疾病。虽然H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)致病力不高，但病毒易变异[3-4]，鸡群感染后往往影响其生长性能和产蛋性能，且易引发继发感染[5-6]，造成重大经济损失。目前疫苗免疫仍然是预防这3种传染病的重要措施。

前期研究中，将免疫原性好、保护谱广的H9N2亚型禽流感流行毒株HuN33株的2个表面基因(HA和NA)与A/PR/8(H1N1)的6个内部基因进行重组，构建获得H9亚型禽流感Re-9疫苗株。基于该毒株成功创制了鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活苗(La Sota株+M41株+Re-9株)(以下简称“三联苗(Re-9株)”)。本研究对三联苗(Re-9株)在实际生产中的有效性进行进一步评价。

1 材料与方法

1.1 疫苗

鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗(La Sota株+M41株+Re-9株)为普莱柯生物工程有限公司GMP车间制备。鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗(以下简称“对照苗”)为市场上购买的某公司生产的疫苗。

1.2 抗原

鸡NDV的血凝抑制(HI)抗原购自中国兽医药品监察所；H9 AIV的HI抗原购自哈尔滨维科生物技术有限公司；IBV的HI抗原购自荷兰GD公司。

1.3 攻毒用毒株

鸡NDV北京株毒种购自中国兽医药品监察所；H9 AIV A/CK/HuN/33/08株(简称HuN33株)由国家兽用药品工程技术研究中心制备、保存。

1.4 试验场所及试验鸡

河南省洛阳市周边某肉鸡养殖场7日龄AA肉鸡，1日龄时进行新支二联活疫苗喷雾免疫。河南省洛阳市周边某蛋鸡养殖场260日龄海兰褐蛋鸡，2周龄时免疫新支流法四联灭活苗，2月龄时免疫新支流三联灭活苗，开产前(105日龄)免疫新支流减四联灭活苗。攻毒试验在普莱柯生物工程股份有限公司禽用负压动物房进行。

1.5 肉鸡应用效果评价

1.5.1 抗体检测

10 000羽7日龄AA肉鸡颈部皮下免疫三联苗(Re-9株)三联苗，0.3 mL/羽。同时设置100只不免疫空白对照鸡。免疫前从鸡群中随机抽取30羽采血并分离血清，分别检测NDV、IBV和H9 AIV的HI抗体。免疫鸡及对照鸡，于免疫后14 d、21 d、出栏当天各随机抽取30羽，采血并分离血清，分别检测上述3种HI抗体。

1.5.2 攻毒保护试验

免疫后14 d在免疫鸡中随机抽取20羽，同时从对照鸡中随机抽取10羽，路途保温带回实验动物房。随机抽取10只免疫鸡及5只对照鸡于负压隔离器中分别通过肌肉注射进行NDV北京株攻毒保护试验，攻毒剂量为105.0ELD50/羽，攻毒后连续观察14 d，攻毒后第5天采集感染鸡泄殖腔拭子，接种10～11日龄鸡胚进行病毒分离；另10只免疫鸡及5只对照鸡通过静脉注射进行H9 AIV HuN33株攻毒保护试验，攻毒剂量为107.0EID50/羽，攻毒后第5天采集所有鸡喉头及泄殖腔拭子，同只鸡的两种棉拭子混合后作为一个样品，接种10～11日龄鸡胚进行病毒分离。

1.6 蛋鸡应用效果评价

8 000羽260日龄产蛋期海兰褐蛋鸡经肌肉注射免疫三联苗(Re-9株)，0.5 mL/羽。同时设置对照苗免疫组，0.5 mL/羽免疫200羽。另设100羽不免疫鸡作为空白对照组。免疫当天、免疫后14 d、28 d、2个月、4个月、6个月分别从三联苗(Re-9株)和对照苗免疫鸡及对照鸡中随机抽取20羽，采血并分离血清，分别检测NDV、IBV和H9 AIV HI抗体，研究三联苗(Re-9株)免疫效果。

1.7 数据统计与分析

使用SPSS软件中的独立样本t检验方法对2组间抗体检测数据进行统计分析，使用ANOVA方法对3组间抗体检测数据进行统计分析，使用Fisher’s exact方法对攻毒保护数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 肉鸡应用效果

2.1.1 抗体检测

7日龄AA肉鸡于免疫当日从鸡群中随机抽取30羽采血并分离血清，免疫后14、21和35 d从免疫组及对照组中各随机抽取30羽采血并分离血清，分别检测NDV、IBV和H9 AIV的HI抗体，结果详见表1。整体来看，对照组抗体值逐渐降低，至出栏当日降到最低，三联苗(Re-9株)免疫后14 d即可激发抗体。免疫后21 d，NDV、IBV和H9 AIV的HI抗体均达到高峰，分别为8.6log2、6.2log2、8.3log2。出栏当日(免疫后35 d)，NDV、IBV和H9 AIV的HI抗体分别为8.2log2、5.9log2、7.9log2，均维持在较高水平。三联苗(Re-9株)免疫AA肉鸡后14、21和28 d的HI抗体水平，均显著高于不免疫对照组。

表1 AA肉鸡免疫后不同时间血清HI抗体检测结果 log2

2.1.2 攻毒保护

免疫后14 d，NDV北京毒株及H9 AIV HuN33株分别通过肌肉注射和静脉注射攻毒，结果见表2。新城疫免疫攻毒组均未发病，排毒比例均为0/10，对照组发病比例为3/5，死亡比例为2/5，未死亡鸡只全部排毒。禽流感免疫攻毒组排毒比例均为0/10，对照组排毒比例为4/5。结果表明，7日龄AA肉鸡免疫三联苗(Re-9株)免疫后14 d即可产生理想的攻毒保护结果。

表2 AA肉鸡免疫后14 d NDV和AIV攻毒保护结果

2.2 蛋鸡应用效果

260日龄海兰褐蛋鸡于免疫当天及免疫后14 d、28 d、2个月、4个月及6个月，血清中NDV、IBV和H9 AIV的HI抗体效价结果详见表3。不免疫对照组随着时间的增加，3种抗体效价逐渐下降。三联苗(Re-9株)和对照苗免疫后NDV、IBV和H9 AIV的HI抗体均在14 d明显上升，28 d达到高峰，NDV HI抗体分别为12.0log2和11.5log2，IBV HI抗体分别为7.8log2和7.7log2，H9 AIV HI抗体分别为12.2log2和9.7log2，而后逐渐下降。免疫后28 d至6个月，两个免疫组的3种抗体均显著高于不免疫对照组，而三联苗(Re-9株)免疫组的NDV、IBV的HI抗体效价与对照苗免疫组无显著差异，但H9 AIV HI抗体效价显著高于对照苗免疫组。免疫后6个月，三联苗(Re-9株)免疫组的H9 AIV HI抗体效价为8.5log2，高于6.5log2的血清学标准，也显著高于对照苗免疫组(5.2log2)。

3 讨论

目前疫苗免疫是防控鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感的重要措施之一。研究表明，H9 AIV不断进化，易变异[7-9]。本产品前期研究中，选择来自8个省份的15株代表性分离株，通过血清交叉试验对毒株抗原性分析，从中选取6个毒株进行交叉攻毒保护试验，发现HuN33株疫苗对同源毒株100%保护，对异源毒株77%～100%保护，抗原保护谱广[10]。但该毒株鸡胚适应性差、增殖滴度低，不适合作为疫苗株直接使用。为攻克这一难题，应用基因重组技术将该野生型毒株与鸡胚高度适应株(PR8株)进行重组，构建的基因重组毒株(Re-9)保持了野生型亲本株良好的免疫原性[11]，且鸡胚增殖能力显著提高，是理想的H9亚型禽流感疫苗株。同时选择经典新城疫疫苗株La Sota和传染性支气管炎疫苗株M41研制出了新支流三联灭活苗。

表3 海兰褐蛋鸡免疫后不同时间血清HI抗体检测结果 log2

据文献报道，NDV、IBV和H9 AIV的HI抗体高低与攻毒保护成正相关[12-13]。根据鸡场的免疫程序，试验鸡前期已经免疫过相应的弱毒活疫苗或灭活苗，故免疫前体内具有一定水平的HI抗体。肉鸡仅在1日龄免疫新支二联活疫苗时，至出栏当天NDV和H9 AIV的HI抗体仅为3.1log2和3.0log2，存在感染风险；蛋鸡对照组在开产前做最后一次免疫，在新支流(Re-9株)免疫后6个月NDV和H9 AIV的HI抗体效价仅为3.5log2和2.9log2，亦存在感染风险。而三联苗(Re-9株)免疫AA肉鸡和海兰褐蛋鸡后14 d即可产生抗体，肉鸡出栏当天仍维持在较高水平，且能提供完全的攻毒保护，故肉鸡在免疫活疫苗后需加强免疫相应的灭活疫苗或做好生物安全防控，蛋鸡需在产蛋高峰期后加强免疫，以保持较高的抗体滴度。由于攻毒时体内仍有部分母源抗体，攻毒对照组未全部发病或排毒。国内有较多厂家生产新支流三联灭活苗，本产品通过与同类产品在蛋鸡上的比较发现，三联苗(Re-9株)NDV、IBV的HI抗体部分与对照苗免疫组相当，但三联苗(Re-9株)H9 AIV HI抗体从免疫后28 d至6个月均显著高于对照苗免疫组。上述结果验证了H9 AIV Re-9株作为基因重组毒株在免疫原性上的优势。新支流三联苗(Re-9株)鸡群免疫后抗体产生快，免疫持续期长，可减少蛋鸡的免疫次数，减少应激，保障养禽业健康。