超声辅助离子液体提取柚子皮总黄酮及其抗氧化研究

★ 李国峰 陈海芳 杜文迪 郭莹帆 蔡锦洪 张武岗（.江西中医药大学中药固体制剂制造技术国家工程研究中心 南昌 0006；.江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室 南昌 0004 ；.江西中医药大学药学院 南昌 0004）

柚子（Citrus grandisL.）为药食同源药材，属于芸香科常绿乔木植物，又称胡栾、文旦等，柚子皮资源分布极其广泛，在我国长江流域以南各省均有栽培［1］。其药用和食用部位主要是果肉，而“柚子皮”经常作为废物被直接丢弃，既浪费资源，又污染环境。近年来，大量实验研究证明总黄酮具有一定的药理作用，王晓波等［2］实验研究发现，鸡骨草总黄酮具有清除自由基及抑制亚硝化作用。王占一等［3］实验研究发现，石榴根皮总黄酮具有较强的清除亚硝酸盐能力和抑制亚硝胺合成能力。

离子液体作为一种新型的绿色溶剂，能够明显的提高活性成分的提取率，而且可以循环利用，可以减少溶剂的消耗量，避免了环境的污染等优点［4］。超声波辅助离子液体提取已经应用于石榴籽中原花青素［5］、山楂绿原酸［6］、葛根总黄酮［7］、籽瓜果胶［8］等活性成分的分离提取中，但是采用超声波辅助离子液体提取柚皮中总黄酮成分的研究，国内还未见文献报道。经过前期实验和从经济成本上考虑，选择 1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体为提取溶剂。

因此本研究以柚子皮为材料，采用超声波辅助提取柚子皮总黄酮，并测定提取、纯化后的产物对羟自由基和超氧阴离子自由基的清除能力，为该成分的工业化生产及保健品的研发提供参考。

1 材料与仪器

1.1 材料 新鲜的柚子购自于福建琯溪沙田柚，芦丁对照品（纯度>98%，批号100080-201202）由中国食品药品检定研究院提供；VC对照品（纯度>98 %，批号C10250787）由上海麦克林生化科技有限公司提供；离子液体由上海源叶生物科技有限公司提供；石油醚、 无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、邻二氮菲、过氧化氢、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸亚铁、邻苯三酚、Tris、盐酸等均为分析纯，超纯水为实验室自制。

1.2 仪器 SHZ-DIII予华牌循坏水式真空泵 （巩义市予华仪器制造有限责任公司）；JA5003B型电子分析天平 （上海精科仪器有限公司）；UV-2000紫外-可见分光光度计 （上海尼龙柯仪器有限公司）；SB25-12DTN型超声波清洗机 （宁波新芝生物科技股份有限公司）；DHG-9246A型电热恒温鼓风干燥箱 （上海精宏试验设备有限公司）；XFB-200型小型多功能粉碎机 （永康市小宝电器有限公司）；TDL－40B低速台式大容量离心机（上海安亭科学仪器厂）；RE52CS-2旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

2 方法

2.1 柚子皮的预处理 将柚子果皮与果肉分开，留下果皮，置于电热鼓风干燥箱中，于65 ℃条件下烘至恒重，放入干燥器中备用。取干燥后的柚子皮粉碎置于索氏提取器中，加入8倍体积的石油醚，加热回流脱脂两次，每次脱脂时间30 min，抽滤，除去石油醚，将得到的柚皮粉末置于在阴凉通风处自然阴干，收集残渣，装入密封袋中备用。

2.2 柚皮总黄酮提取与纯化 称取粉碎至规定粒度的经过脱脂处理好的柚皮粉末2.0 g，置于100 mL干燥具塞锥形瓶中，加入0.2 mol/L的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体的乙醇溶液至设定料液比例。设定超声波输出功率，在规定的温度下提取至设定时间后，提取液在3 000 r/min转速下离心10 min，得到上清液，然后在旋转蒸发仪上适当浓缩后定容，作为供试品溶液。将供试液置于250 mL具塞锥形瓶中，用预处理好的AB-8大孔吸附树脂进行摇床吸附 40 min（300 r/min，25 ℃），抽滤，得到含药树脂。含药树脂用75 %乙醇超声处理后，抽滤，滤液减压浓缩，最后用超纯水定容至100 mL容量瓶中，用于后续的抗氧化实验。

2.3 芦丁标准曲线的制备 精密称取芦丁对照品20.0 mg，置于100 mL容量瓶，加30 %乙醇适量使其溶解，放冷，定容，摇匀，即得对照品溶液（0.20 mg/mL）。精密吸取芦丁对照品溶液0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL 于 25 mL 容量瓶中。各加入 5 % 亚硝酸钠溶液 1.00 mL，摇匀，放置 6 min。加入 10 %硝酸铝溶液 1.00 mL，摇匀，放置 6 min。加入 4 %氢氧化钠6 mL，用30 %乙醇定容，摇匀，放置15 min。以30 %乙醇同法制备空白对照，在510 nm处用紫外-可见分光光度计测定吸光度，重复3次取平均值，以吸光度A为纵坐标，浓度C（mg/mL）为横坐标绘制标准曲线，得回归方程。

2.4 柚皮总黄酮含有量测定 将纯化后的提取液用超纯水定容100 mL容量瓶中，作为供试品试液。按照2.3的方法，测定吸光度，根据标准曲线的回归方程得出柚皮黄酮的浓度，计算，即得。公式如下：

式中w为柚皮黄酮得率（%），c为测定黄酮的浓度（mg/mL），V为供试液的体积（mL），n为稀释倍数，M为柚皮的质量（g）。

2.5 工艺优化 在单因素试验中，考察料液比（A，1∶8、1∶12、1∶16、1∶20、1∶24） 、超声功率（B，100、150、200、250、300 W） 、超声时间（C，20、30、40、50、60 min）对总黄酮提取率的影响。在单因素试验基础上，以总黄酮提取率为考察指标，采用三因素三水平的正交试验法，不考虑各因素间的相互影响，对柚子皮总黄酮的提取工艺条件进行优化，因素-水平表见表1

表1 因素水平表

2.6 柚皮总黄酮体外抗氧化活性

2.6.1 样品溶液的配制 以纯化的柚皮黄酮提取液为样品，测定提取液中总黄酮的浓度。以VC为对照品，配制成与提取液总黄酮的浓度相同的对照品溶液，然后依次倍数稀释成五个样品液，用于后续的体外抗氧化试验。

2.6.2 柚皮总黄酮对·O2-自由基清除力的测定 参考文献［9-10］方法。精密吸取5.0 mL配制好的Tris-HCl缓冲液（pH值8.2）于10 mL具塞刻度试管中，滴加对应浓度的待测供试液，用超纯水补至 9.7 mL，于 25 ℃的恒温水浴锅中保温 20 min，取出后加入同温水浴中预热后的3mmol/L邻苯三酚试液0.3 mL。立刻混匀，倒入比色皿中，以10 mmol/L HCl溶液作为空白对照，在325 nm波长下以30 s为一区间测吸光度A，一共测定4 min，绘制吸光度A与作用时间t相关联的线性图，所得的关联图中纵横坐标比值即为样品的自氧化速率ΔA1/Δt。用超纯水代替样品液，所得的关联图中纵横坐标比值即为邻苯三酚的自氧化速率ΔA2/Δt，以VC作为对照。

按照下列公式计算清除率。

式3-1中：D1%为羟基自由基清除率；ΔA1/Δt为加入药品后的邻苯三酚自氧化速率；ΔA2/Δt为邻苯三酚自氧化速率；ΔA为差的平均值。

2.6.3 柚皮总黄酮对·OH自由基清除率的测定 参考文献［11-12］方法。精密吸取1.0 mL的0.75 mmol/L邻二氮菲试液于10 mL具塞刻度试管中，然后分别加入0.2 mol/L磷酸缓冲溶液（pH值7.4）1.0 mL 和超纯水 1.0 mL，立即混匀，在吸取 1.0 mL的 0.75 mmol/L 的 FeSO4，摇匀后加入 3%H2O2分别1.0 mL启动反应，轻轻振摇使混匀，再将混合溶液在 37 ℃水浴温热 60 min，于波长 511 nm 处测定吸光度AB。将H2O2代替样品溶液1.0 mL，按照上述过程测定AS。将等同体积的样品液代替超纯水，按照上述流程测定AP。以VC作为对照，各组试验平行3次， 以蒸馏水为空白，然后在536 nm的波长下测定各个试管中混合溶液的吸光度，按照下列公式计算清除率

式3-3中：D2%为羟基自由基清除率；AP为样品液所测吸光度；AB为不加样品所测吸光度；AS为不加H2O2所测吸光度。

3 结果

3.1 芦丁标准曲线 以芦丁的浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标，得线性回归方程为Y=10.484X-0.0042，R2=0.999 7。 在 芦 丁 浓 度 在0.016～0.08 mg/mL的范围内，芦丁浓度与吸光度呈良好的线性相关。

3.2 单因素实验结果

3.2.1 超声功率对总黄酮提取率的影响 结果见图1，随着超声功率的增大，柚皮黄酮得率也随之增大，当超声功率超过200 W后，柚皮黄酮得率随超声功率增加变化并不明显，从节约能源角度考虑，确定超声功率为200 W。

图1 超声功率对总黄酮得率的影响

3.2.2 超声时间对总黄酮提取率的影响 结果见图2，在20～40 min提取时间范围内，随着提取时间的延长，柚皮总黄酮含量逐渐增加，40 min时，达到峰值，超过40 min时，柚皮总黄酮含量略微下降。提取时间过长或过短都会影响柚皮总黄酮的含量，提取时间过短，总黄酮溶出的不充分，提取时间延长，总黄酮含量略有降低。因此，综合考虑能源和时间成本，选择超声提取时间为40 min。

图2 超声时间对总黄酮得率的影响

3.2.3 料液比对总黄酮提取率的影响 结果见图3，当料液比增加时，柚皮总黄酮的含量明显升高，当料液比1∶16（g/mL）时，柚皮总黄酮含量最高，再持续增加溶剂量不会持续增加柚皮总黄酮得率反而会降低。料液比越小，溶剂不足，无法完全提取出总黄酮，料液比越大，溶剂用量越大，在后续浓缩处理中会有部分损失，而且成本也会增加。从试验工艺和经济成本考虑，因此选择料液比为1∶20（g/mL）。

图3 料液比对总黄酮提取的影响

3.3 正交试验结果 结果见表2。表2直观分析可以知，料液比对柚皮总黄酮含量的影响最大。极差R的大小顺序为A>B>C，即影响柚皮总黄酮提取率各因素中的主次关系依次是料液比>超声功率>超声时间。柚皮粗黄酮的最佳提取工艺条件为 A3B2C3。即料液比 1∶20，超声功率 200 W，超声时间50min。

表2 正交试验表

3.4 验证实验结果 按照优选出来的工艺进行三次验证试验，提取率分别为 1.18 %、1.12 %、1.15 %，平均值为1.16 %。结果表明该工艺稳定可行。

3.5 柚皮总黄酮体外抗氧化活性结果

3.5.1 柚皮总黄酮对.O2-自由基清除的测定 结果见图4，柚皮黄酮和VC对·O2-有一定的清除作用，并且清除率随供试液质量浓度的提高逐渐增加。当柚皮黄酮质量浓度在0～0.5 μg/mL范围内时，其清除率水平与VC几乎相近；大于此值后，VC对·O2-的清除率明显大于柚皮黄酮的清除率。在质量浓度为0.5～2.5 μg/mL时，VC对·O2-的清除率为52.2 %，柚皮黄酮对·O2-的清除率为41.4 %，说明柚皮黄酮对·O2-有一定的清除作用，但其清除效果低于同浓度的VC。

图4 总黄酮和VC对.O2-自由基的清除作用

3.5.2 柚皮总黄酮对·OH自由基清除的测定 结果见图5，柚皮黄酮和VC对·OH均有一定的清除作用，并且清除率随柚皮黄酮和VC浓度的升高而逐渐上升。在质量浓度为0～1 μg/mL时，柚皮黄酮和VC对·OH清除率随柚皮总黄酮和VC浓度的增加上升明显；在质量浓度为1～2.5 μg/mL时，VC对·OH的清除率为68.8 %，柚皮黄酮对·OH的清除率为43.8 %，说明柚皮黄酮对·OH有一定的清除作用，但其清除效果低于同浓度的VC。

图5 总黄酮和VC对·OH自由基的清除作用

4 讨论与结论

本试验应用超声辅助离子液体提取柚子皮总黄酮，在单因素试验基础上选择料液比、超声时间、超声功率作为影响因素，发现三者对总黄酮提取率的影响程度依次为料液比>超声功率>超声时间，所得最优工艺下总黄酮稳定可行。再对该成分进行抗氧化活性评价，发现在 0.5～2.5 μg/mL 质量浓度范围内 其对羟自由基、超氧阴离子均具有较强的清除能力，并呈一定量效关系。由于体内自由基的积累与疾病关系密切，如癌症、骨质疏松等，因此应继续研究柚皮中具有抗氧化作用的总黄酮的提取纯化工艺和其清除体内自由基的相关机制，可为该成分提取和抗氧化活性物质开发提供理论依据。