胰岛素超多孔水凝胶控释制剂的制备及其检测

胡等慧，王秀丽，任蕾蕾 （北京中医药大学中药学院，北京 102488）

超多孔水凝胶（SPF）是一种三维结构的亲水性高分子聚合网格，在水中能够溶胀但不溶解，且因其具有良好的生物相容及生物可降解性，被广泛应用于医学、药学等领域。与传统水凝胶相比，超多孔水凝胶通过致孔剂、模板等方法调整孔隙率，从而改变溶胀速率以及释药速率[1-3]。胰岛素等生物大分子类药物不仅体内稳定性差、易被酶解、生物半衰期短、不易透过生理屏障，故现有给药方式多以注射为主，患者依从性差[4]。有研究显示[5]，超多孔水凝胶承载胰岛素灌胃后可以显著降低大鼠血糖：给药2 h 后血糖显著下降，4～6 h 降至最低，但12 h 即回至最初血糖的80%，说明该制剂起效快但持续时间短，血糖波动大，需频繁给药，患者依从性差。上述情况，结合胃肠道对胰岛素的灭活等原因，本实验拟合成具有缓释作用的聚（丙烯酸-丙烯酰胺）/O-羧甲基壳聚糖[P(AA-co-AM)/O-CMC]互穿网络聚合物超多孔水凝胶（SPH-IPN），以期通过皮下给药包载胰岛素的SPH-IPN 后，实现长效、减小血糖波动的目的。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

丙烯酰胺（AM）、丙烯酸（AA）、N,N′-亚甲基-双丙烯酸胺（Bis）、过硫酸铵（APS）、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMED）均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；泊洛沙姆127（PF127，北京化工厂）；O-羧甲基壳聚糖（O-CMC，大连美仑生物技术有限公司）；戊二醛（GA，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；姜黄素（宝鸡国康生物科技有限公司）；牛胰岛素（上海源叶生物有限公司）；十二烷基硫酸钠（SDS）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、碳酸氢钠、盐酸、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、氢氧化钠均为分析纯，实验用水为去离子水。

1.2 仪器

85-2 型恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）；恒温水浴锅（余姚市东方电工仪器厂）；透析袋（Viskase，美国）；Nicolet iS50 傅里叶变换红外光谱仪（Thermo，美国）；AVANCE III 400 核磁共振谱仪（Bruker，德国）；FE28 型pH 计（Mettler Toledo，美国）；Waters UPLC：二元溶剂管理系统、在线脱气机、自动进样器、PDA 检测器（Waters 公司，美国）；TTL-DC 型多功能氮吹仪（北京同泰联科技发展有限公司）；SHA-B 双功能恒温水浴振荡器（常州金坛良友仪器有限公司）。

1.3 实验动物

雄性SD 大鼠，体重范围（220±20）g，合格证号：SCXK（京）2017-0002，购自北京斯贝福实验动物科技有限公司，饲养于北京中医药大学动物房。

2 方法与结果

2.1 超多孔水凝胶（SPH-IPN）的制备[5]

依次向西林瓶中加入50% AM 和AA 溶液，以10 mol/L NaOH 调节pH 至5.0。随后再加入2.5% Bis 溶液、10% PF 127 溶液、20%APS 溶液和50 μl 16.7% TEMED 溶液，磁力搅拌混匀。室温放置15 min 后，逐滴加入 6% O-CMC 溶液，使溶液中O-CMC/单体比（w/w）为0.144，迅速加入NaHCO3粉末，搅拌约20 s 使其产生气泡，将其置于40 ℃水浴加热5 min，室温固化30 min，即得半互穿网络水凝胶（semi-IPN）。将所得semi-IPN 置于GA/OCMC 比（w/w）为2∶10 的GA 溶液（用0.2 mol/L的盐酸溶液调节pH 至1.0）中至将其吸干，室温放置1 h，得粗P(AA-co-AM)/O-CMC 超多孔水凝胶（SPH-IPN）。将SPH-IPN 置于0.1 mol/L 盐酸溶液中，透析5 d，无水乙醇中脱水透析2 d，30 ℃烘干至恒重，干燥密闭保存，即得纯化后的SPH-IPN。

2.2 SPH-IPN 的结构表征

将样品充分干燥，KBr 压片法制样，使用傅里叶变换红外光谱仪测定500～4 000 cm-1波数的SPHIPN 的IR 谱。将样品置于氧化锆样品管（A=4 mm），转速5 000 Hz，固体碳谱测定。

2.3 SPH-IPN 的溶胀性能测定

取干燥的SPH-IPN，室温下浸于过量水中（pH 7.0），于不同时间点用筛网取出SPH-IPN，吸去表面残余水后称重，根据以下公式计算SPH-IPN 在不同时间点的溶胀比（QS）：

其中，WS为溶胀后SPH-IPN 质量（g）；Wd为干SPH-IPN 质量（g）。

2.4 SPH-IPN 孔隙率测定

采用乙醇替代法测定SPH-IPN 的孔隙率[6]。取干燥的SPH-IPN，置无水乙醇中浸泡12 h，取出后吸去表面残余乙醇，称重，根据以下公式计算孔隙率：

其中，M1为干SPH-IPN 质量（g）；M2为乙醇浸泡后的SPH-IPN 质量（g）；ρ 为乙醇密度（g/cm），V 为SPH-IPN 体积（cm3，以游标卡尺测量长方体SPH-IPN 的长、宽、高后计算而得）。

2.5 载胰岛素SPH-IPN 的制备及含量测定

2.5.1 载胰岛素SPH-IPN 的制备

取胰岛素15 mg，精密称定，置10 ml 量瓶中，加0.1 mol/L pH 7.4 PBS 溶解并定容至刻度，得1.5 mg/ml的胰岛素溶液。称取50 mg SPH-IPN 置装有10 ml胰岛素溶液的西林瓶中，37 ℃温浴放置2 h，取出，置烘箱内，30 ℃恒温干燥。

2.5.2 载药量的测定

取胰岛素SPH-IPN 适量，研磨粉碎，取20 mg，精密称定，置10 ml 量瓶中，加入0.1 mol/L pH 7.4 PBS，定容至刻度。37 ℃温浴2 h，超声10 min，精密量取上清液20 μl 注入HPLC 仪，记录色谱图，计算胰岛素含量，并根据以下公式计算载药量：

其中，c 为测得胰岛素的浓度（mg/ml），V 为量瓶体积（ml），M 为SPH-IPN 的质量（mg）。

2.6 载胰岛素SPH-IPN 降血糖实验

2.6.1 不同方法载药SPH-IPN 的制备

按“2.5.1”项下方法制备载胰岛素SPH-IPN，采用冷冻干燥法将其冻干即得含胰岛素的冻干SPHIPN。称取空白凝胶200 mg 置于1.5 mg/ml 的胰岛素溶液37 ℃中溶胀2 h，备用，即得含胰岛素的预溶胀SPH-IPN。

2.6.2 糖尿病大鼠模型的建立

给大鼠喂食高脂饲料（88.8%基础饲料、1%胆固醇、10%猪油和 0.2%胆盐[7]）喂养4 周，动物自由进食和饮水，每周记录体重。于喂养的第28 天晚禁食，在第29 天一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ）35 mg/kg，将一次性注射STZ 3 d 后大鼠空腹血糖≥11.1 mmol/L 或随机血糖≥16.7 mmol/L作为成模标准[8]。对照组大鼠则腹腔注射无菌生理盐水（0.3 ml/100 g）。注意测血糖前应禁食12 h，空腹测血糖。造模期间要防止感染，注意消毒。未造模成功的大鼠再次注射STZ35 mg/kg，3 d 后测血糖验证是否造模成功。

2.6.3 分组、给药及血糖测定

取糖尿病大鼠12 只，按随机数字表分为2 组，即模型1 组和模型2 组；取正常大鼠12 只，按随机数字表分为2 组，即正常1 组和正常2 组。模型组1 组和正常1 组皮下埋植含胰岛素的预溶胀SPH-IPN，模型2 组和正常2 组皮下埋植含胰岛素的冻干SPH-IPN。给药后分别于1、2、4、6、8、10、12、24、28、32、36、48、60、72 h 不同时间间隔大鼠尾部取血0.02 ml，用血糖仪测定血糖值，考察不同时间血糖值的变化情况。

3 实验结果

3.1 IPN 结构表征

3.1.1 傅立叶变换红外光谱（FTIR）

图1 为SPH-IPN 的FTIR 图。在1 651 cm-1处有-COOH 的伸缩振动峰，且1 615 cm-1附近无AA 和AM 的C=C 双键吸收峰，说明已聚合成P(AA-co-AM)，SPH-IPN 中存在P（AA-co-AM），图中3 335 和2 922 cm-1处分别为-O-H 和-C-H 的伸缩振动峰；1 604 和1 416 cm-1处分别为羧酸盐-COO-的反对称伸缩振动峰和对称伸缩振动峰；1 086、1 044 和1 171 cm-1处分别为O-CMC 中糖环羟基-CH-OH、一级羟基-CH2-OH 和醚基C-OC 中的C-O 伸缩振动峰。以上结果表明SPHIPN 中存在P(AA-co-AM)，还存在的一些杂峰可能是还有一些未反应单体未被除尽。

图1 SPH-IPN 的傅立叶变换红外光谱

3.1.2 核磁共振（13C-NMR）

图2 为SPH-IPN 的13C-NMR 图。图中41.926×10-6为P(AA-co-AM)上主链碳原子的化学位移峰；179.499 处为羧基碳原子的化学位移峰，说明结构中含有羧基官能团，AA 与AM 已聚合形成P(AAco-AM)。

由于制得的水凝胶未找到合适的溶液将其溶解，因此在测定核磁共振图谱时，采用的是固体核磁技术[9]。

综合红外和碳谱结果可知，通过该方法可聚合形成P(AA-co-AM)结构，而该结构又是超多孔水凝胶SPH-IPN 的主要结构，由此可说明已成功聚合SPH-IPN。

图2 SPH-IPN 的核磁共振碳谱

3.2 SPH-IPN 的溶胀性能

图3 为不同温度介质中SPH-IPN 的溶胀曲线，可见随着温度升高，SPH-IPN 的溶胀速率加快，平衡溶胀比增大，原因是温度较高时相互缠绕的聚合物链松开，破坏分子间的氢键，增加链运动，水分子在凝胶骨架内外的扩散速率加快，从而促进了聚合物的溶胀[10]。

图3 不同温度下SPH-IPN 的溶胀性

3.3 SPH-IPN 孔隙率的测定

表1 为SPH-IPN 孔隙率测定结果，所制SPHIPN 超多孔水凝胶空隙分布均匀。除此之外，与传统水凝胶相比[11]，孔隙率高，更利于药物的释放。

表1 SPH-IPN 的孔隙率测定结果

3.4 SPH-IPN 载胰岛素含量测定结果

37 ℃时SPH-IPN 溶胀比较大，温度过高易引起胰岛素变性，故选择37 ℃温度载药，胰岛素的载药量试验结果见表2。

表2 SPH-IPN 对胰岛素的载药量

3.5 载胰岛素凝胶降血糖实验

图4 是含胰岛素的预溶胀SPH-IPN 和冻干SPH-IPN 对糖尿病大鼠和正常大鼠降糖作用的比较。图中预溶胀模型组在10 h 时血糖值才有所降低，最低值为10 h 的16.8 mmol/L，之后血糖又开始慢慢升高；预溶胀正常大鼠组在给药4 h 后血糖开始降低，到24 h 时血糖达到7.3 mmol/L，之后维持平稳状态；冻干模型组在包埋1 h 后血糖便开始下降，血糖值降到6.7 mmol/L，在24 h 后血糖开始慢慢升高，冻干正常大鼠组在1 h 后血糖降至5.3 mmol/L，之后虽有起伏，但也一直在正常范围内。说明冻干凝胶的降糖作用较预溶胀组好，冻干凝胶在1～24 h时间段内的降糖作用较平稳。

图4 载胰岛素SPH-IPN 的降糖作用

4 讨论

4.1 SPH-IPN 的制备

本实验选用了能够迅速聚合的水溶性原料AA、AM 为聚合反应单体；以APS/TEMED 为引发体系；PF127 为泡沫稳定剂，使产生的泡沫稳定时间更长；NaHCO3为起泡剂；O-CMC 在合成过程中作为增稠剂，维持合适的起泡速率，使产生的气泡均匀、稳定，不致产生的气泡过快逸散[12]。采用溶液聚合法制备了含semi-IPN 的水凝胶。因为该聚合反应在反应过程中会产生大量热量，这对泡沫的稳定极为有利，因此在常温条件下便能进行聚合反应，条件温和。以pH 1.0 的GA 溶液交联O-CMC时，可避免过度溶胀对孔隙结构的破坏，且pH 1.0时GA 的交联能力较好。除此之外，相较于参考文献[5]，本实验中O-CMC/单体比较高，当O-CMC/单体比为0.144 时，虽然可形成具有大量相互贯通孔隙的聚合物，但会导致其溶胀速率减慢，溶胀比降低，从而影响载药量和释药速率。随着溶胀速率减慢，药物溶出速率也相应减慢；随着溶胀比的降低，吸收的药物溶液减少，载药量随之降低。本实验提高O-CMC/单体的目的是希望通过减慢SPHIPN 的溶胀速率，从而尝试制备缓释制剂。

4.2 水凝胶的载药方法

水凝胶的载药方法通常有2 种：一是将药物与单体溶液混合，随着单体聚合、交联将药物包埋于水凝胶中[13]；另一种方法为吸附载药，即凝胶在被载药液中溶胀，将载药水凝胶干燥，实现药物包埋[14]。姜黄素属于脂溶性药物，课题组前期研究结果表明，0.5%的SDS 对姜黄素有一定的增溶效果；0.1 mol/L pH 7.4 PBS 中SPH-IPN 的溶胀比较大，对胰岛素具有一定的增溶作用，故分别选用这两种溶剂配制胰岛素溶液。

4.3 超多孔水凝胶的释药性能

文献[5]表明，超多孔水凝胶载药后的释药性能与O-CMC 的含量、pH、离子强度、温度等多个因素有关，同时也有可能与载药SPH-IPN 的制备过程有关。

笔者曾用SPH-IPN 包载姜黄素，并开展探索性实验。结果发现20、40、60 目不同粒径的凝胶累积释放率不同，前13 h 三者的累积释放率均几乎一样（接近0），13 h 后累积释放率逐渐增加，以40 目凝胶的效果最佳，48 h 后达到6.00%，明显高于其他组，但其释放速度慢，见图5。灌胃给予载姜黄素SPH-IPN 后，部分大鼠排泄物中可见载姜黄素SPH-IPN，说明SPH-IPN 在体内溶胀速率很慢；而载姜黄素SPH-IPN 组和姜黄素原药组，灌胃后大鼠眼眶血中均未检出姜黄素，也进一步体现SPH-IPN 未促进姜黄素的吸收。

图5 不同粒径载姜黄素SPH-IPN 的释药情况

将载胰岛素SPH-IPN 予灌胃给药溶胀很慢，降糖效果极不明显，为延长SPH-IPN 溶胀时间，最终考虑将其进行皮下包埋给药。

载胰岛素SPH-IPN 皮下包埋给药发现，载胰岛素冻干SPH-IPN 组的降糖效果优于载胰岛素溶胀SPH-IPN 组，表明载药SPH-IPN 的释放性能除与溶胀比有关外，其制备过程也会一定程度影响被载药物的疗效，与文献[5]报道一致。实验中将冻干组和溶胀组均进行包埋，均可延长溶胀时间，但冻干SPH-IPN 组的降糖效果优，皮下包埋2 h 后表现出明显的降糖作用，相比溶胀组而言，起效时间快（8 h 左右）且持续时间长，24 h 之内均具有良好的降糖作用。提示我们在制备载药SPH-IPN 的过程中应该时刻关注被载药物的活性及稳定性，应在适当的条件下对药物进行包载以提高药物疗效，同时也说明载胰岛素冻干SPH-IPN 可作为控释制剂，实现调节大鼠血糖的目的。结合实验结果分析可知，SPH-IPN 能够增强药物的稳定性，提高生物利用度，比较适合作为蛋白质药物给药载体。

4.4 SPH-IPN 载胰岛素的微针给药展望

文献研究发现，胰岛素经皮给药具有不错的疗效，与皮下给药效果几无差异，且依从性好，成为最新、有效、方便的给药方式。Norduist 等[15]将微针贴剂用于胰岛素给药，结果发现，血浆胰岛素浓度变化与传统的皮下注射并无太大差异，但微针贴剂能极大地提高实验大鼠的依从性。无痛中空微针皮内胰岛素给药系统已获得 FDA 批准，进入II 期临床，相关产品有以色列纳米通道技术公司采用MEMS 技术开发的中空微针器具，其中包括用于无痛释放胰岛素薄片与胰岛素微型泵相结合。Liu 等[16]将可溶性材料透明质酸制备成负载胰岛素的微针阵列。在体实验发现，负载胰岛素的微针能够在1 h 内完全溶解，携带的胰岛素快速释放入体内。

与上述研究及应用相比，本实验的载胰岛素SPH-IPN，释放药物无需微型泵，皮下包埋给药可以24 h 内保持平稳、正常的血糖浓度，适合作为一日一次给药的控释制剂。为了提高患者的依从性，进一步研究将载胰岛素SPH-IPN 制备为微针阵列的形式，以期得到一种方便、快捷、安全的胰岛素缓释递药系统。