雌激素-雌激素受体通路影响母鸡脂肪肝发生的可能机制

姚 宏 胡 艳 饶开晴 施寿荣*

(1.中国农业科学院家禽研究所，扬州225125；2.西南民族大学生命科学与技术学院，成都610041)

脂肪肝综合征(fatty liver syndrome，FLS)是产蛋期母鸡常见的一种亚临床代谢综合征，主要发生于产蛋高峰的蛋鸡、种鸡[1]，脂肪肝综合征呈渐进性发展(图1-A、图1-B、图1-C、图1-D)，到产蛋后期发生率高达95%以上，特别是一些地方品种表现尤为严重，对母鸡健康和产蛋性能造成极大影响。从病理学角度而言，肝脏中脂肪含量大于肝脏湿重5%，或油红O染色显示有30%以上的肝细胞发生脂肪变性，即可判定为脂肪肝[2](图1-E、图1-F)。当肝脏中脂肪含量升高，肝脏会肿大、发黄、脆性增加，容易破裂，引发脂肪肝出血综合征(fatty liver hemorrhage syndrome，FLHS)[4](图1-A、图1-B、图1-C)。到产蛋后期，脂肪肝还可能发展为肝纤维化和硬化(图1-D)。由于脂肪肝是在蛋鸡产蛋性能的高度开发过程中表现出来的一种特有的生理性、代谢性肝损伤，目前尚无法通过遗传改良、药物添加等方式加以预防，深入了解该病征的发生和发展的诱因和分子机制，找出关键的调控环节，是解决这一难题的关键。鸡FLS的病因复杂，其发生机制尚未明了，已发现激素在其发生、发展过程中起着关键作用[5-9]。

鸡的雌激素主要由卵巢生成和分泌，雌二醇(E2)是蛋鸡血液和卵巢中主要存在的雌激素[10]，可防止内脏脂肪堆积[11]。雌激素的作用由雌激素受体(estrogen receptor，ER)介导[12]，ER具有转录因子的作用，ERα和ERβ是介导雌激素作用的2个主要受体，二者与雌激素的亲和力存在差异，ERα对雌激素的亲和力高于ERβ，ERβ可能在循环雌激素水平较高时才被激活。由于ERα和ERβ转录激活功能区[13]的变异较大，导致二者对同一基因的表达调控出现差异[14-15]。雌激素以配体形式与ER结合，参与脂质代谢调控[16-17]，且小鼠上的相关研究表明ERα和ERβ对脂肪代谢具有相反的作用[18-19]。随着母鸡开产和产蛋率的逐渐提高，血清中E2含量逐渐上升，进入产蛋高峰期血清中E2含量达到最高并维持2～3个月的平台期[7,9]，进入产蛋后期血清中E2含量随着产蛋性能的下降而显著下降。伴随着产蛋率和内源性雌激素水平的攀升，母鸡肝脏脂肪合成增加[8]，以形成足够的卵黄前体物质保证卵泡的成熟，完美扮演产蛋角色；与此同期，母鸡的脂肪肝病症发生并呈渐进性发展。笔者认为，产蛋期母鸡肝脏的高负荷脂肪合成，可能是导致母鸡FLS发生的直接原因；产蛋后期母鸡脂肪肝的发生和发展与持续的高雌激素水平直接相关。雌激素和ER对代谢性疾病的发生发展具有重要意义，本文就雌激素-ER通路对母鸡脂肪肝发生的可能机制进行综述。

A：健康肝脏；B：脂肪肝；C：脂肪肝血管破裂；D：脂肪肝并有硬化结节；E：健康肝脏油红O染色[3]；F：脂肪肝油红O染色[3]。

1 母鸡脂肪肝的致病因素

1.1 卵黄前体物质的合成压力

鸡蛋形成过程中，卵黄的生成需要大量的脂质沉积，卵巢自身合成脂质的能力很低或几乎没有，这一任务主要由肝脏承担。在雌激素的作用下，蛋鸡肝脏完成卵黄前体物质的合成[20]。卵黄前体物质主要有2个成分：极低密度脂蛋白(VLDL)和卵黄生成素(VTG)，二者占蛋黄干物质总量的84%。蛋鸡开产后，在雌激素的作用下肝脏由合成VLDL转向大量合成极低密度脂蛋白y(VLDLy)，VLDLy沉积为卵黄脂肪，VTG沉积到卵泡成为卵黄蛋白，雌激素参与调控VTG的合成[21-22]。因此，蛋鸡肝脏的脂肪代谢功能和产蛋密切相关，脂肪的合成直接影响VLDL生成，进而影响卵黄前体物质的合成和运输。由于产蛋的需要，肝脏内合成的脂肪约50%以上被运送到卵巢中用于卵黄的形成，在雌激素的刺激下，肝脏内脂肪合成旺盛，合成量几乎等同于肝脏自身重量[23],造成肝脏代谢负担过重，进而导致产蛋后期蛋鸡脂肪肝的发生。

1.2 雌激素的持续高水平

雌激素是由内分泌系统产生的类固醇性激素，具有广泛的生理作用。在哺乳动物脂肪代谢调节过程中，雌激素-ER通路具有促进脂肪细胞分化、促进脂解、抑制脂质合成的功能，从而减少脂肪在脂肪组织中的沉积。在哺乳动物肝脏脂肪代谢调节过程中，雌激素和ER抑制脂质在肝脏中沉积[24]。值得关注的是，过高的雌激素水平容易诱发肥胖，影响卵泡发育。有研究发现，雌激素与脂肪肝形成有一定关系，患有FLHS的病鸡，血浆中雌激素平均含量为1 019 μg/mL，而正常鸡为305 μg/mL[25-26]。Haghighi-Rad等[27]发现，强制饲喂平均采食量的120%和135%，诱发蛋鸡FLHS后，血浆雌激素含量由对照组的165 pg/mL分别增加到194和247 pg/mL，推测FLSH的发生可能与内源性雌激素的高水平有关。有研究报道，给蛋鸡外源注射E2(2.0～7.5 mg/kg)，蛋鸡肝脏脂肪含量、肝脏出血指数均显著高于对照组，说明雌激素可以成功诱发蛋鸡FLHS[28]。产蛋高峰期的海兰褐蛋鸡外源性注射7.5 mg/kg E2，肝脏出血指数和肝脏脂肪含量显著升高，注射雌激素后蛋鸡FLSH发生率为70%[29]。雌激素可加速VLDL的合成，由载脂蛋白极低密度脂蛋白-Ⅱ(Apo VLDL-Ⅱ)加工、修饰形成VLDLy释放到血液。同时需要微粒体甘油三酯转运蛋白(microsome triglyeride transport protein，MTTP)的参与，MTTP能加快膜间甘油三酯、磷脂和胆固醇的转运，促进载脂蛋白B(ApoB)的分泌。VLDL的合成分泌受阻将导致肝脏甘油三酯代谢紊乱，而脂类在载脂蛋白B-100(ApoB-100)或MTTP突变将促进肝脏中甘油三酯沉积[30-31]。这些研究表明，雌激素是母鸡脂肪肝的发生和发展的因素之一，源于高雌激素水平促进卵黄前体物质生成，从而导致脂质合成与蓄积增加。

1.3 肝脏脂质代谢稳态的改变

肝脏脂质稳态主要由脂质摄取、合成、降解、转运以及β-氧化等代谢通路相互协调来维持[32]。蛋鸡在高度集约化养殖和遗传选育中，产蛋率逐步增加，肝脏的代谢强度逐渐加大。在正常生理状况下，肝脏储存脂肪的能力很低，甘油三酯在肝脏中合成后与白蛋白结合，以VLDL的形式进入血液，然后转运到其他体组织[29]。禽蛋的形成需要大量脂质成分，母禽外源获取的脂肪酸无法满足机体所需，还需要通过自身合成。肝脏是家禽体内脂质合成的主要场所，约95%的脂肪酸在肝脏中合成[33]。胆汁酸作为胆汁的重要成分，参与调控脂肪代谢。研究发现，次级胆汁酸的代谢功能与肝脏脂肪沉积程度显著相关。胆汁酸与肠道菌群互作，其代谢产物如三甲胺、脂多糖等穿过肠屏障，通过门静脉进入肝脏，可以导致肝脏中的甘油三酯合成与沉积增加，继而推动脂肪性肝病的发展[34-38]。在发生FLHS的蛋鸡肝脏中，脂肪酸β-氧化功能降低，而脂肪细胞生成能力增强[29]；外源性注射皮质酮成功构建鸡脂肪肝模型，证实发病鸡肝脏甘油三酯合成增加，且线粒体发生β-氧化损伤[3]；有研究者采用干涉雏鸭的脂肪合成相关基因的表达的方法，导致成纤维细胞不能发育为脂肪细胞，从而降低脂肪沉积[34]。上述研究说明，肝脏脂肪酸过度合成和β-氧化受损造成的肝脏脂质代谢稳态发生变化是脂肪肝发生的关键因素。

2 雌激素-ER参与脂肪肝发生的分子机制

2.1 雌激素-ER介导小异源二聚体伴侣受体(small heter-domer partner，SHP)表达上调

机体内的胆汁酸合成存在负反馈调节机制，正常生理状态下胆汁酸能消化和吸收来自食物的脂肪，发挥生理调节作用；同时胆汁酸也可作为信号分子，特异性激活法尼醇X受体(farnesoid X receptor，FXR)等，影响肠道微生态、糖脂代谢。肝脏产生的初级胆汁酸和被肠道细菌代谢过的次级胆汁酸之间存在一个平衡，次级胆汁酸推动了肝脏疾病的发展[39]。次级胆汁酸能够激活肠道FXR，产生神经酰氨，神经酰氨进入肝脏以后促进肝脏脂肪合成和堆积[40]。SHP是抑制胆汁酸合成的重要转录因子，有研究发现，SHP能够封堵芳香烃受体(arylhydrocarbon receptor，AhR)对磷脂酰乙醇胺-N-甲基转移酶(phosphatidylethanolamine N-methyltransferase，PEMT)和甘氨酸-N-甲基转移酶(glycine N-methyltransferase，GNMT)基因表达的作用，从而使磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)含量发生变化，PC含量过高或过低均会导致肝脏甘油三酯含量增多，推动肝脏脂肪变性进程[41]。FXR是激活SHP转录的重要上游因子[42-43]，ERα激动剂丙基吡唑三醇(propyl pyrazoletriol，PPT)对ERα的相对亲和力高于ERβ，PPT增加野生型小鼠肝脏中SHP的表达[44]，使胆汁酸合成降低。同时，由于FXR和SHP存在级联关系，是否会因为ERα表达增高使得胆汁酸合成减少，从而导致肝脏脂肪堆积和合成增加，促进肝脏脂肪变性，还需进一步研究。

2.2 雌激素-ER介导脂肪合成变化

ERα保护肝脏免受高胆固醇血症的影响，用ER激动剂阿考比芬治疗小鼠，野生型小鼠的体重、脂肪质量及血浆胆固醇、甘油三酯和胆固醇含量减少，但对ERα-/-小鼠无效[45]。虽然ERα是肝脏中主要受体，但ERβ在肝脏组织中也具有一定的功能，喂食高脂肪饮食的ERβ-/-小鼠甘油三酯的积累和肝脏重量降低[46]。目前大量的研究观点认为ERα的表达与体内激素水平的改变呈正相关。雌激素与ERα结合后可降低解偶联蛋白-1(uncoupling protein 1，UCP-1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-α(peroxisome proliferator activated receptor γ coactivator-1α，PCG-1α)成脂信号的表达，从而降低脂肪酸的合成[47-48]。蛋鸡外源性注射雌激素诱发FLHS，过氧化物酶体增殖物受体α(peroxisome proliferator activated receptor α，PPARα)mRNA表达量有下降趋势，线粒体羟甲基戊二酸单酰辅酶A合成酶(3-hydroxy-3methyl glutaryl coenzyme a synthetase，HMG-CoAS)和过氧化物酶体增殖物受体γ(peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ)mRNA表达水平升高，表明HMG-CoAS和PPARγ在雌激素诱发蛋鸡FLHS形成过程中发挥作用[29]。在3T3-L1细胞中，ERβ抑制剂上调瘦素表达而ERα抑制剂下调瘦素表达，提示ERα与ERβ比例与3T3-L1细胞瘦素表达有关[49]，促进或抑制脂肪细胞的合成。

2.3 雌激素-ER介导β-氧化损伤

有研究报道，通过抑制线粒体β-氧化过程能增加肝脏甘油三酯含量，下调β-氧化基因胆固醇-7α-羟化酶(cholesterol-7alpha-hydroxylase，CYP7A1)的mRNA表达水平和线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A，TFAM)、细胞色素c氧化酶亚基4I1(cytochrome c oxidase subunit 4I1，COX4 I1)的蛋白表达水平以及线粒体拷贝数，造成β-氧化损伤，成功构建脂肪肝模型[3]。有研究认为肝脏脂肪含量增加，可能是雌激素导致肝脏线粒体的脂肪酸氧化能力下降。非诺贝特是一种贝特类药物，对抗雌激素药物有增敏作用，其可通过PPARα维持体重稳定，降低低密度脂蛋白(LDL)、VLDL和甘油三酯含量，并且能升高高密度脂蛋白(HDL)含量，可用来治疗高胆固醇血症和高甘油三酯血症。研究表明，非贝诺特能减轻雄性小鼠的体重增加和脂肪组织质量，但不能降低雌性小鼠的体重和脂肪组织质量，以及血浆总胆固醇含量[50]。非贝诺特降低去势雌性即去除雌激素-ER通路小鼠的体重，但对卵巢功能正常的雌性小鼠没有影响[51]，雌激素可能通过抑制PPARα调节靶基因的作用而抑制PPARα对肥胖和脂质代谢的作用[52]。线粒体作为脂肪酸β-氧化的主要细胞器，在脂质稳态等多种代谢途径中发挥调节作用。以上研究说明雌激素-ER通路影响激活线粒体β-氧化的关键转录因子PPARα的表达来参与脂质代谢，但其在该过程中的作用机制需进一步研究。

3 缓解脂肪肝的方法和机制

3.1 外源添加类雌激素

鉴于母鸡肝脏生理性脂肪化机制未研究透彻，期望通过营养代谢的方式加以缓解肝脏的脂肪变性程度。黄酮类化合物可根据体内ER以及雌激素水平的高低，不同程度地与ER结合，发挥协同或拮抗作用；当体内雌激素分泌水平较低时，低剂量外源黄酮与体内雌激素协同诱导发情或乳腺发育；当体内雌激素分泌水平较高时，高剂量外源黄酮与体内雌激素拮抗对生殖系统无明显作用[10]。产蛋高峰期尼克蛋鸡饲粮中添加900 mg/kg苜草素，38周龄时产蛋率增加2.65%，通过下调3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGCR)mRNA表达量，降低了肝脏中胆固醇含量0.42 mg/g[53]；在高能低蛋白质饲粮中添加800和1 000 mg/kg苜草素能降低产蛋高峰期和后期京红1号蛋鸡FLSH的发生，产蛋高峰期蛋鸡FLHS发生率降低了20%，产蛋后期蛋鸡FLHS发生率降低了13%[54]。三羟异黄酮通过PPARα、PPARγ和肝X受体途径调控脂肪甘油三酯脂酶(ATGL)的表达，促进甘油三酯分解转化，在人体L-02、Hep G2、Hep 3b细胞中三羟异黄酮激活PPARα效果最为显著；而在小鼠3T3-L1细胞中，三羟异黄酮对PPARγ激活效果最强。这说明在人体细胞中，三羟异黄酮可能主要通过PPARα途径调控脂肪代谢，而在小鼠细胞中主要通过PPARγ途径调控[55]。茶多酚和大豆黄酮能降低38周龄海赛克斯蛋鸡血浆中总胆固醇、TG和LDL含量，大豆黄酮添加量为10 mg/kg时，产蛋率提高了7.2%；茶多酚添加量为40 mg/kg时，产蛋率提高了5%；茶多酚添加量为20 mg/kg时，蛋黄中甘油三酯含量降低了14.7%，且茶多酚具有降低蛋鸡肝脏脂肪含量的作用[56]。

3.2 调控肝脏脂质稳态

3.2.1 影响SHP水平

0.4%大黄素灌胃可升高急性淤胆型肝炎大鼠肝脏组织中SHPmRNA以及蛋白表达水平，减轻肝脏组织病理学损害[57]。大黄素通过降低毛细血管通透性，使血液黏滞度降低，促进胆汁排除，加快胆固醇在肠内还原为类固醇并排出体外，减少胆固醇的体内沉积，同时还能促进高脂血症大鼠肝脏LDLmRNA表达水平，降低血脂水平[58]。30周龄海兰褐蛋鸡饲粮中添加0.06 g/kg胆汁酸，能抑制脂肪酸的从头合成，促进脂肪酸β-氧化，蛋鸡血液和肝脏中的甘油三酯含量分别降低了2.1 mmol/L、1.8 μmol/g[59]。越来越多的研究报道，DNA甲基化与慢性肝脏疾病的发生有关或联系密切，DNA甲基化修饰通过调控肝脏内细胞脂质代谢、炎症反应、细胞增殖活化、基因与蛋白的表达，进而影响肝脏酒精性肝病、病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝以及肝癌等肝脏疾病的发展进程[60-64]。甜菜碱作为甲基供体能够增加肝脏中S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)含量，SAM通过磷脂酰乙醇胺N甲基转移酶(phosphatidylethanolamine N-methyltransferase，PEMT)调节PC的合成，使脂肪肝中异常的VLDL生产速率正常化，从而阻止高脂饮食或酒精诱导的甘油三酯在肝脏中沉积[65-66]，添加甲基供体后PC和SAM含量发生变化。有研究认为SHP是PC和SAM的调节因子，缺失SHP的小鼠对PC和SAM调节变化减弱；人类脂肪肝患者中，单纯性脂肪肝患者的SHP以及PC含量都有所升高[44]。由以上研究推测，大黄素类和甲基供体类等物质可能参与机体SHP含量的调节，但其具体的调节机制以及SHP介导的胆汁酸代谢过程是否变化尚不明确。

3.2.2 缓解β-氧化损伤

有研究报道，饲粮中添加0.15%甜菜碱可提高产蛋后期巴布考克蛋鸡8.13%的产蛋率，显著降低料蛋比[67]；在藏鸡中也发现饲粮中添加1 000 mg/kg的甜菜碱可显著提高藏鸡产蛋率以及蛋黄中的粗脂肪含量[68]。38周龄如皋黄羽蛋鸡饲粮中添加0.5%甜菜碱，产蛋率可达84.5%，比对照组增加4.3%[69]；且如皋黄鸡蛋内注射甜菜碱2.5 mg/个，可以缓解皮质酮诱导的肝脏β-氧化基因PPARα和CPY7A1的表达下降，以及CPY7A1基因的启动子区和mtDNA的D-Loop区DNA甲基化水平的变化[3]。80 μmol/L白藜芦醇能够通过PPARα介导的转录途径促进海兰褐蛋鸡肝脏原代细胞中脂肪酸的氧化，从而缓解细胞脂肪变性的损伤[70]。饲粮中添加0.05%硫磺酸通过维持线粒体膜电位稳定，改善FLHS蛋鸡线粒体功能障碍，减少肝细胞内脂质沉积，对肝脏损伤具有保护作用[71]。有研究证实，饲粮中添加丙酮酸肌酸通过激活肝脏β-氧化基因PPARα和CPY7A1 mRNA表达升高，可降低42日龄肉鸡腹脂率及血清、肝脏中TG含量，升高血清中HDL-C含量，提高血清中瘦素含量可加快肉鸡的脂肪分解，促进脂肪酸β-氧化降低脂肪沉积[72]。大蒜素能降低肉仔鸡肝脂率和腹脂率，同时降低血清中TG、TC以及LDL-C含量，上调肝脏和腹脂中脂蛋白脂肪酶(LPL)mRNA表达水平，通过促进脂肪的降解来影响脂类代谢[73]。脂肪酸合成酶(FAS)是脂肪酸合成的关键酶，饲粮中添加5 mg/kg叶酸极显著提高了肉仔鸡肝脏中FAS基因的甲基化比率，抑制了FAS基因的表达[74]。小鼠饲喂20%果糖，导致肝脏脂质蓄积，PPARα和肉毒碱棕榈酰转移酶1A(carnitine palmitoyl transferase 1A，CPT1A)基因启动子区高度甲基化，PPARα和CPT1A基因表达下调[75]。上述研究说明，通过改善线粒体功能，激活β-氧化相关基因的表达，能够一定程度的缓解β-氧化损伤，促进肝脏脂质代谢。

4 小结与展望

综上所述，脂肪肝作为一种严重影响母鸡生存生产的代谢性疾病，病因复杂，雌激素水平不仅与母鸡生产性能相关，同时也是脂肪肝发生发展的因素之一。患有FLHS的病鸡血浆中雌激素含量上升，且外源性注射雌激素能成功引发蛋鸡FLHS。介导雌激素生理作用的ER有2种亚型——ERα和ERβ，协同参与脂质代谢的调节；ERα激动剂PPT使SHP表达增加，胆汁酸合成减少，雌激素与ERα结合后通过降低成脂信号的表达从而降低脂肪酸的合成，雌激素通过抑制β-氧化基因的表达影响脂质代谢。

尽管对雌激素和ER在脂肪代谢中的作用已有所了解，但仍有许多问题有待探讨。例如，雌激素能改善肝脏脂肪代谢而高雌激素水平容易诱发肥胖，导致这种互相矛盾的结果的原因是什么？哺乳动物雌激素-ER通路对脂肪代谢的影响已有研究，遗憾的是，蛋鸡生产过程中高雌激素水平伴随着肝脏脂质的积累，而雌激素-ER这一通路在该过程中的作用仍不明确。目前，对于饲粮中额外添加不同的添加剂以缓解FLS的研究较为丰富，然而雌激素水平的变化情况仍未可知。ERα和ERβ分布不同，功能也有所差异，因此代谢疾病的发生与2种受体之间的比例是否有关？这些问题都值得进一步深入研究，对于雌激素替代药物以及雌激素抑制剂开发等方面具有重要指导意义。