电针对控制性超排卵小鼠子宫内膜同源盒基因A10表达时相的影响

张磊,刘杰,张英,王芳,李长雷,刘骥才,刘小亚,付艾妮,游俊,朱书秀

(1.江汉大学医学院,武汉 430056;2.湖北省妇幼保健院,武汉 430070)

正常子宫内膜仅在一个极短的时期内允许胚胎着床,即“种植窗期”,一般在排卵后6～9 d开放,持续1～2 d[1]。在体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer, IVF-ET)治疗不孕症时,控制性超排卵(controlled ovarian hyperstimulation, COH)可获取多个卵泡,同时也出现了高雌激素和高孕激素现象[2],导致子宫内膜提早发育成熟,卵子与子宫内膜发育不同步,出现妊娠率低下。子宫内膜同源盒基因 A10(HOXA10)对子宫内膜的发育进行着精密的时空调节[3],在细胞增殖和胚胎着床方面起着重要作用。针灸治疗不孕症历史悠久,大量临床报道也证实了针灸治疗对不孕症有理想疗效[4-5]。近年来,国内外开展了大量研究,综合其作用机制为调节下丘脑-垂体-卵巢轴的功能[6],改善卵巢血供及促进卵子的成熟、排出[7-8],改善子宫内膜容受性[9-10],调节血清雌孕激素水平[11]。本研究通过观察不同妊娠天数小鼠子宫内膜的HOXA10、整合素avβ3及白血病抑制因子(LIF)蛋白及 mRNA的表达变化,来探讨电针提高IVF-ET临床妊娠率的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

昆明纯种性成熟小鼠,SPF级,8周龄,体质量30～35 g,其中雌鼠150只,雄鼠80只(用于交配),由武汉春玉红实验动物饲料有限公司提供(动物合格证号42000600023408)。将小鼠置于室温18℃～22℃、相对湿度60%～80%的环境中,自由摄食、饮水。取50只雌鼠为自然周期组,剩余100只雌鼠制备COH模型并随机分为COH组(50只)和电针组(50只)。各组内再根据妊娠天数分为 D2、D3、D4、D5和 D6小组,每小组10只。实验过程中对动物的处置符合2006年科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》的规定[12]。

1.2 主要试剂与仪器

曲普瑞林(法国益普生生物制药有限公司);孕马血清促性腺激素(宁波三生药业有限公司);绒促性素(HCG,丽珠集团丽珠制药厂);Trizol(美国 Ambion公司);cDNA第一链合成试剂盒(立陶宛 Fermentas公司);HOXA10抗体(美国GeneTex公司);整合素αvβ3抗体(美国 Abcam公司);LIF抗体(中国台湾 Origo公司);Western-blot主要试剂购自碧云天公司。PCR仪(东胜创新生物科技有限公司,EDC-810);荧光定量PCR仪(美国ABI公司,QuantStudio 6);酶标仪(美国Thermo公司,mµlISKANMK3);水平电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司,JY300);韩氏电针仪(HANS-100A,南京济生医疗科技有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 模型制备方法

采用控制性超促排长方案制备COH小鼠模型[13]。每天上午腹腔内注射曲普瑞林(每 100 g体质量注射0.4 μg),连续9 d;第9天同时注射孕马血清促性腺激素(每100 g体质量注射40 U)1次,进行Gn启动;48 h后注射人绒毛膜促性腺激素(HCG,每100 g体质量注射100 U),与雄鼠合笼。

1.3.2 电针干预

取关元、中极和三阴交(双),采用0.16 mm×7 mm美容针灸针,进针深度2 mm,关元和中极分别接韩氏电针仪两极。连续波,频率2 Hz,强度1 mA,留针15 min。于HCG注射日开始治疗,至取材日停止。仅电针组行电针干预,自然周期组和COH组小鼠不行电针治疗。

1.3.3 胚胎着床的观察与计数

取各组 D6小组,尾静脉注射 0.3 mL 0.5%台盼蓝,5 min后颈椎脱臼处死。用75%乙醇消毒腹部皮肤,打开腹腔,暴露双侧子宫,被台盼蓝染为蓝色即为小鼠胚胎的着床位点。计算小鼠妊娠率和平均着床位点数。妊娠率=(孕鼠数/总动物数)×100%。平均着床位点数=(总着床位点数/妊娠鼠数)×100%。

1.3.4 子宫内膜HOXA10、整合素αvβ3和LIF蛋白表达

取各组D2、D3、D4、D5小组小鼠子宫内膜组织,用Western blot技术检测子宫内膜HOXA10、整合素αvβ3和LIF的蛋白表达。电动匀浆器匀浆,采用细胞裂解液提取总蛋白,经 SDS-PAGE电泳分离蛋白,湿转法将目的蛋白转到PVDF膜上,一抗、二抗依次孵育。通过凝胶成像系统观察拍照。运用Image-J图像分析软件分析,采用目的蛋白与内参的比值比较各组蛋白表达水平。

1.3.5 子宫内膜 HOXA10、整合素αvβ3和 LIF mRNA的表达

取各组D2、D3、D4、D5小组的小鼠子宫,纵行剖开子宫,剥离子宫内膜,剔除囊胚,用RT-PCR技术检测子宫内膜HOXA10、整合素αvβ3和LIF mRNA的表达。采用Trizol提取组织内的RNA,并根据反转录试剂盒说明书进行反转录,反应条件为25℃下5 min、50℃下15 min、85℃下5 min和4℃下10 min。获得第一链cDNA后,以GAPDH为内参,实时定量PCR扩增反应检测HOXA10、整合素αvβ3、LIF的mRNA表达量变化,引物序列见表1。反应条件为50℃下2 min、95℃下10 min、95℃下30 s和60℃下30 s,40个循环。荧光定量分析软件自动绘制扩增动力曲线和溶解曲线。基因相对表达量采用2﹣△△CT的方法进行分析。

表1 引物序列

1.4 统计学方法

实验数据采用SPSS19.0软件进行统计分析。计数资料比较采用卡方检验。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示,组内各小组之间比较采用单因素方差分析,进一步通过Tukey和SNK检测的方法分析两组之间的差异。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠妊娠率及着床位点数

经控制性超排卵后,COH组妊娠率低于自然周期组,差异具有统计学意义(P＜0.05),且平均着床位点数显著高于自然周期组(P＜0.01)。电针治疗后,电针组妊娠率与COH组比较,差异无统计学意义(P＞0.05),但呈现增长趋势;平均着床位点数比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。详见表2。

表2 各组小鼠妊娠率及着床位点数

2.2 子宫内膜HOXA10、整合素αvβ3和LIF蛋白表达

自然周期组中,D4小组 HOXA10、整合素αvβ3和LIF蛋白表达最高,与D2、D3、D5小组比较,差异有统计学意义(P＜0.01),结果见图1。COH组中,D3小组表达最强,与D2、D4、D5小组比较,差异具有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01),结果见图2。电针组中,D4小组达到峰值,与D2、D3、D5小组比较,差异具有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01),结果见图3。

图1 自然周期组小鼠子宫内膜HOXA10、整合素αvβ3和LIF蛋白表达

图2 COH组小鼠子宫内膜HOXA10、整合素αvβ3和LIF蛋白表达

图3 电针组小鼠子宫内膜HOXA10、整合素αvβ3和LIF蛋白表达

2.3 子宫内膜HOXA10、整合素αvβ3和LIF mRNA表达

2.3.1 各组不同妊娠天数小鼠子宫内膜HOXA10 mRNA表达情况

自然周期组中D4小组HOXA10 mRNA表达最高,与D2、D3、D5小组比较差异具有统计学意义(P＜0.01);COH组中D3小组HOXA10 mRNA表达最强,与D2、D5小组比较差异具有统计学意义(P＜0.01);电针组中 D4小组HOXA10 mRNA表达最高,与D2、D5小组比较差异具有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01),与 D3小组比较表达增加,但差异无统计学意义(P＞0.05)。详见表3。

表3 各组不同妊娠天数小鼠子宫内膜HOXA10 mRNA表达情况 (±s)

表3 各组不同妊娠天数小鼠子宫内膜HOXA10 mRNA表达情况 (±s)

注:与同组D4小组比较1)P＜0.01,2)P＜0.05;与同组D3小组比较3)P＜0.01

组别 D2 D3自然周期组 1.000±0.0001) 1.741±0.2231)COH 组 0.974±0.4543) 2.275±0.256电针组 0.995±0.2171) 1.734±0.066 D4 D5 2.248±0.265 1.722±0.1771)1.693±0.222 1.212±0.2523)1.902±0.234 1.457±0.1092)

2.3.2 各组不同妊娠天数小鼠子宫内膜整合素αvβ3 mRNA表达情况

自然周期组中D4小组整合素αvβ3 mRNA表达最高,分别与D2、D3和D5小组比较差异具有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01);COH组中D3小组整合素αvβ3 mRNA表达最强,分别与D2和D5小组比较差异具有统计学意义(P＜0.05);电针组中整合素αvβ3 mRNA表达最高为D4小组,分别与D2和D5小组比较差异具有统计学意义(P＜0.05),与D3小组比较表达增加,但差异无统计学意义(P＞0.05)。详见表4。

表4 各组不同天数孕鼠子宫内膜整合素αvβ3 mRNA表达 (±s)

表4 各组不同天数孕鼠子宫内膜整合素αvβ3 mRNA表达 (±s)

注:与同组D4小组比较1)P＜0.01,2)P＜0.05;与同组D3小组比较3)P＜0.01

组别 D2 D3自然周期组 1.000±0.0001) 1.396±0.4251)COH 组 0.965±0.6013) 2.140±0.658电针组 0.957±0.2642) 1.621±0.347 D4 D5 2.154±0.242 1.475±0.2562)1.608±0.381 1.133±0.3553)1.937±0.356 1.306±0.3072)

2.3.3 各组不同妊娠天数小鼠子宫内膜LIF mRNA表达情况

自然周期组中,D4小组LIF mRNA表达最高,分别与 D2、D3和 D5小组比较,差异具有统计学意义(P＜0.01);COH组中,D3小组LIF mRNA表达最强,分别与D2、D4和 D5小组比较,差异具有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01);电针组中,D4小组LIF mRNA表达最高,分别与 D2和 D5小组比较,差异具有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01),与 D3小组比较,表达增加,但差异无统计学意义(P＞0.05)。详见表5。

表5 各组不同天数孕鼠子宫内膜LIF mRNA表达 (±s)

表5 各组不同天数孕鼠子宫内膜LIF mRNA表达 (±s)

注:与同组D4小组比较1)P＜0.01,2)P＜0.05;与同组D3小组比较3)P＜0.01,4)P＜0.05

组别 D2 D3自然周期组 1.000±0.0001) 1.590±0.2441)COH 组 0.810±0.4873) 2.357±0.175电针组 0.896±0.2481) 1.839±0.236 D4 D5 2.470±0.401 1.608±0.151)1.649±0.2384) 1.068±0.1563)2.066±0.361 1.412±0.0412)

3 讨论

LIF是白细胞介素-6家族中的细胞因子之一,在胚胎着床中发挥重要作用。种植窗期,子宫内膜分泌LIF,与囊胚表达的 LIF受体结合,促进囊胚植入子宫内膜[14]。整合素αvβ3可参与滋养细胞的黏附,在子宫内膜细胞和滋养层细胞上呈现周期特异性表达,其表达高峰与“种植窗期”吻合[15]。因此,与LIF、胞饮突等均为评估种植窗期的重要指标[16]。

本研究发现,自然周期组子宫内膜整合素αvβ3和LIF在见阴栓后第4天达到峰值,说明受孕后第4天为小鼠种植窗期,COH组中,作为评估种植窗期的重要指标的整合素αvβ3和LIF在受孕后第3天表达最高,表明子宫内膜发育提前,同时观察到临床妊娠率下降,说明超排卵药物改变子宫内膜的发育进程,种植窗期提前开放,受精卵与子宫内膜发育不同步,是 IVF-ET临床妊娠率低的原因。

中医学虽无“种植窗”的概念,但古代文献对其相关内容进行了一定描述。如张景岳曾提出:“此言妇人经期方止。其时子宫正开,便是布种之时,过此佳期,则子宫闭而不受胎矣。”中医学认为“肾藏精,主生殖”,《医学衷中参西录》中“男女生殖,皆赖肾脏作强”。在 IVF-ET中,超排卵耗伤大量肾阴肾精,导致精血不足,冲任虚衰,胞脉失养,而难以摄精成孕。关元、中极和三阴交为临床治疗不孕症的常用穴位[17]。三阴交为足三阴经交会穴,可滋补肝肾、调理冲任;关元、中极为任脉要穴。《素问》王冰注“冲为血海,任主胞胎,两者相资,故能有子”。三穴相配,共补肾精、调冲任。

同源盒基因(HOX)属于多基因家族的转录调节基因,从3’到5’端分别有HOXA1～13,与生殖密切相关的有HOXA9、10、11和13。HOXA10是一种多效的转录调节因子,在胚胎着床及发育、细胞分化与增殖方面具有重要意义[18]。子宫内膜HOXA10表达减少可出现着床失败和蜕膜化障碍[19]。临床研究[20]发现,输卵管性不育和反复植入失败的妇女,子宫内膜 HOXA10和 HOXA11启动子的甲基化水平表达异常。动物研究[21]显示,HOXA10突变小鼠子宫内膜不能正常植入胚胎,而将HOXA10突变小鼠的胚胎移植到野生型小鼠子宫内,着床成功,说明母体HOXA10的良好表达是胚胎着床所必须的条件之一。HOXA10的表达贯穿整个月经周期,并随月经周期呈现周期性改变,在种植窗期,高水平雌激素和孕激素作用下,子宫内膜HOXA10表达呈现高峰状态[22-23]。在研究中发现,经过电针治疗后,子宫内膜整合素αvβ3和LIF在受孕第4天表达最高,种植窗期恢复正常。HOXA10的表达在受孕第4天达到峰值,较COH组推迟1天,临床妊娠率呈现上升趋势,表明电针可能通过调控HOXA10的表达时相,来调节种植窗期的开放与关闭。

综上所述,针刺调控COH小鼠子宫内膜HOXA10的表达时相,恢复正常种植窗期,使受精卵与子宫内膜发育同步,是电针提高IVF-ET临床妊娠率的作用机制之一,但电针通过何种途径来调控 HOXA10的表达时相,尚需进一步研究。