基于质量源于设计理念优化龙黄泻肝颗粒中栀子苷的分析方法

彭永政，王汝山

作者单位：529500 广东省阳江市中医医院药学部

质量源于设计（QbD）理念即通过设计科学、合理、可靠的工艺过程来提升产品质量的合格率，该理念在制药领域产品和工艺的开发中已得到广泛应用［1-3］。近年来，QbD 理念逐渐渗透到了药品分析方法的开发中，基于QbD理念建立的药品质量分析方法引入了关键质量属性、关键分析参数、实验设计、分析设计空间等概念［4-5］。通过运用科学知识、风险评估、合适的实验设计及统计分析，研究关键质量属性与关键分析参数之间的数学规律，寻找分析设计空间。

龙黄泻肝颗粒为本院制剂，由龙胆、栀子、黄芩、泽泻等十味中药精心配制而成，具有清利肝胆湿热，泻肝经实火，清热解毒，提高机体免疫力等功效，适用于头晕目赤、湿热带下、尿赤涩痛诸症［6］。栀子为方中的一味重要主药，其主要药效成分为栀子苷，具有缓泻、利胆、清热、镇痛等功效［7］。测定栀子苷的含量对控制龙黄泻肝颗粒的质量具有一定价值，目前常规的栀子苷检测一般借助于简单方便的薄层色谱法（TLC）和准确稳定的高效液相色谱法（HPLC）［8-10］。本研究在前期HPLC 实验中，发现在龙黄泻肝颗粒中，栀子苷色谱峰的后面存在干扰峰，两者不易基线分离，需对色谱条件进一步开发优化对栀子苷进行准确的定量检测。因此将QbD 理念运用于HPLC 测定龙黄泻肝颗粒中栀子苷分析方法建立中，采用Plackett-Burman 设计（PBD）筛选影响栀子苷色谱峰分离度关键因素，然后运用中心组合设计（CCD）对关键分析参数进一步优化，并通过分析设计空间指导建立可靠的分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料 LC-20AD 型高效液相色谱仪（日本岛津公司），AB204-N 型万分之一天平（美国梅特勒-托利多公司），AB135-S 型十万分之一电子天平（美国梅特勒-托利多公司），UPW-20N 型超纯水器（北京历元电子仪器有限公司），SB25-12DTD 型数控超声清洗器（上海新芝生物科技股份有限公司），所用玻璃仪器均为天玻牌A 级。龙黄泻肝颗粒（医院自制，规格：12 g×12 袋/包，批号：170601、170602、170603），栀子苷对照品（批号：111685-201115，中国食品药品检定研究院），乙腈、甲醇（色谱纯，德国默克公司），其余涉及试剂均为分析纯。

1.2 方法与结果

1.2.1 溶液制备 对照品溶液制备：精密称定栀子苷对照品11.20 mg，置于100 ml 容量瓶中，加入50%甲醇溶液，超声5 min 后定容，摇匀，得对照品储备液（质量浓度为0.1120 mg/ml）。供试品溶液的制备：取适量龙黄泻肝颗粒，用研钵研细，精密称定细粉1.0 g，置25 ml 容量瓶中，加适量50%甲醇溶液，超声提取30 min 后定容，摇匀，过滤膜，取续滤液。

1.2.2 色谱条件 色谱柱为Zorbax SB C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美国安捷伦公司），流动相由一定体积分数的磷酸水溶液和乙腈组成，检测波长为238 nm；其他条件根据实验设计确定，乙腈在流动相的比例为13%～17%，磷酸体积分数为0～0.1%，流速为0.8～1.2 ml/min，柱温为25～35 ℃，进样量为5～15 μl。

1.2.3 Plackett-Burman 设计筛选关键分析参数 根据经验及预实验，以流动相中乙腈比例（A）、磷酸体积分数（B）、流速（C）、柱温（D）、进样量（E）为5个考察因素，栀子苷色谱峰与后面干扰峰的分离度（Y）为关键属性质量。

2 结果

2.1 PBD 实验方案与结果 通过PBD 对Plackett-Burman 设计筛选关键分析参数具有一定风险的因素进行筛选，使用Design Expert 8.0 软件对数据进行分析，实验方案与结果见表1，因素筛选Pareto 分析见图1。实验结果得出A、B、C、E 对关键属性质量均具有负影响作用，D具有正影响作用。其中流动相中乙腈比例（A）、流速（C）对关键属性质量具有显著性（P＜0.05），为关键分析参数。其他因素为非关键分析因素，故磷酸体积分数、柱温、进样量分别设为0%、25 ℃、10 μl。

表1 PBD 实验方案与结果

2.2 中心组合设计优化液相条件 基于PBD实验结果，通过CCD 对流动相中乙腈比例（X1）、流速（X2）2个关键分析参数进行优化，建立其与关键质量属性之间的数学模型，实验方案及结果见表2，方差分析见表3。Y 模型的R2=0.976，回归方程为Y=+17.91-0.12X1-19.21X2+1.19X1X2-0.05X12-1.07X22。表3 可知乙腈比例与流速对龙黄泻肝颗粒中栀子苷分离度的影响均具有显著性（P＜0.05），与PBD 所得的实验结果一致。

图1 因素筛选Pareto 分析图

表2 CCD 的实验方案及响应值

表3 CCD 回归模型方差分析

2.3 设计空间的计算与验证 建立流动相中乙腈比例、流速的分析设计空间，该空间需满足栀子苷分离度＞1.5。由于设计空间边缘点的达标概率较低，在定义设计空间时加入95%CI，以提高准确性。优化的设计空间结果见图2，亮黄色区域为优化后的设计空间，其中所有点的预测值有95%概率符合各关键质量属性的目标范围，暗黄色部分属于设计空间内不可靠的部分。根据实际情况，流速过大则会增加仪器压力，缩短色谱柱寿命，为保护色谱柱和便于操作，X1 的上下限设为13.0～15.5%，X2 的上下限设为0.8～1.0 ml/min，即图中的橘黄色区域。结合实际情况选取2 个不同区域内的实验点，a 为设计空间内的实验点，b 为设计空间外的实验点，每个点平行实验三次，实验值与预测值的结果见表4。两个点的实验值与预测值均较接近，即说明模型的预测功能较好，设计空间内实验点的实验值满足关键质量属性，设计空间外实验点的实验值未同时满足关键质量属性，说明设计空间内的分析条件能够较好地保证龙黄泻肝颗粒液中栀子苷色谱峰的分离。

2.4 方法学验证 选定设计空间内的一组液相色谱条件进行方法学验证：色谱柱Zorbax SB C18柱，柱温25 ℃，流动相为水和乙腈（85：15，v/v），流速1.0 ml/min，等度洗脱，检测波长238 nm，进样量10 μl。龙黄泻肝颗粒液相色谱见图3，栀子苷色谱峰峰形良好，与后面干扰峰的分离度为1.84，且分析时间较短。

2.5 线性与范围 分别精密吸取栀子苷对照品储备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml，置10 ml 容量瓶中，加入50%甲醇水定容，摇匀，配制成11.2、22.4、33.6、44.8、56.0 μg/ml 的系列溶液，按2.6 项检测，以栀子苷峰面积为纵坐标Y（mV×min），质量浓度为横坐标X（μg/ml），计算所得线性方程为Y=14 264X+3 264.9，R2=0.999 9，在11.2～56.0 μg/ml 内线性良好。

2.6 精密度试验 取同一份栀子苷对照品溶液，按2.6项连续进样6 次，计算栀子苷峰面积的相对标准偏差（RSD）为0.61%，即仪器设备精密度良好。

2.7 重复性试验 按2.2.2 项平行制备6 份龙黄泻肝颗粒供试品溶液，按2.6 项检测，计算栀子苷浓度的RSD为0.60%，即分析方法重复性良好。

2.8 稳定性试验 取同一份龙黄泻肝颗粒供试品溶液，分别在0、1、2、4、8 h 时按2.6 项检测，结果显示栀子苷峰面积RSD 为1.02%，即供试品溶液8 h 内稳定。

表4 实验值与预测值的比较结果

图2 加入95%CI 的设计空间图

图3 龙黄泻肝颗粒液相色谱图

2.9 加样回收率试验 分别精密称取6 份已知栀子苷含量（批号：170601）的龙黄泄肝颗粒细粉0.5 g，置25 ml 容量瓶中，各加入栀子苷对照品储备液4.0 ml，摇匀，按2.2.2 项制备供试品溶液，按2.6 项检测，计算加样回收率。见表4，方法的准确度良好。

表4 加样回收率试验结果

2.10 样品的含量测定 取3 批不同批号的龙黄泻肝颗粒，按2.2.2 项各平行制备2 份供试品溶液，按2.6 项对样品中栀子苷的含量进行测定。见表5。

表5 样品中栀子苷含量测定结果（mg/g）

3 讨论

QbD 理念在分析方法开发中的应用与在药品工艺开发中的应用过程具有类似性，其目标在于开发出能准确、可靠评价药品质量结果的方法。本研究运用QbD 理念开发龙黄泻肝颗粒中栀子苷分析方法的具体步骤如下［11］：（1）确定分析目标，即检测龙黄泻肝颗粒中的栀子苷；（2）选择合适的分析技术，即选择HPLC 技术；（3）确定关键分析属性，即选择栀子苷的分离度作为分析方法优劣的评价指标；（4）通过风险评估辨识分析过程中的关键分析参数，即通过PBD 实验考察流动相中乙腈比例、磷酸体积分数、流速、柱温、进样量的影响，筛选出流动相中乙腈比例、流速为关键分析参数；（5）通过实验设计和统计分析建立设计空间，即通过CCD实验对流动相中乙腈比例及流速进行优化，建立数学模型及分析设计空间；（6）对建立的分析方法进行确认，即对开发的HPLC 检测龙黄泻肝颗粒中栀子苷的定量分析方法进行方法学验证。

QbD 理念指导分析方法建立的最关键过程为实验设计过程［12］。以往HPLC 分析方法的开发通常选择单变量法，实验次数较多。QbD 方法中涉及的实验设计通常采用多变量法，常用的有响应面设计，如CCD 和Box-Benhnken 设计（BBD），用于建立设计空间。BBD 的因素个数一般在3～6个，对应的实验次数为15～62次；CCD的因素个数一般在2～6个，实验次数为13～90次。在因素个数相时，BBD 所需的实验次数较少，但CCD有较多超出原定水平的实验点，具有更好的拟合响应曲面［13］。采用响应面法优化研究时，因素的增加会极大地增加实验次数，因此进行实验设计前，需先对影响分析结果的因素进行筛选，如PBD 实验，可通过较少的实验次数从众多影响因素中筛选出关键分析参数，利于后续实验设计工作的开展［14］。

本研究运用QbD 理念开发龙黄泻肝颗粒中栀子苷HPLC 分析方法，引入了风险评估、实验设计、设计空间等手段，深入了对分析方法开发过程的理解，科学、合理筛选影响因素，不仅减少了实验次数，而且提升了整个优化过程的系统化、结构化。此外由于建立了设计空间，有较多数量的分析条件可选用，提高了该分析方法的耐用性，利于分析方法的转移。