食品包装和接触竹材的壳聚糖防腐研究

李 楠，丁 冰，顾 双，王向阳

（浙江工商大学食品与生物工程学院 杭州310018）

竹子资源在我国森林资源中占有重要地位。我国竹子种类繁多，占地面积广，产出量大[1-3]。竹材是一种可再生天然材料，质量轻，成本低，已成为世界经济建设中重要的原材料[4]。然而，竹材损毁的主要原因是自身腐朽[5]，因此提高竹材的耐腐性对于竹制品市场非常重要。目前，竹材防腐剂主要是使用木材的防腐剂，其主要有铜铬砷氧化物（Chromium Copper Arsenic，CCA） 和烷基铜铵化合物（Alkaline Copper Quaternary，ACQ）。CCA 由铜、铬、砷的化合物组成，其中砷元素以As2O5形式存在，固着在木材纤维上，不溶于水，抗流失性较好；ACQ 主要是由氧化铜和季胺盐组成，不含砷和铬，近年来逐步代替CCA。另有研究者使用铜唑（CA）、壳聚糖金属配位聚合物（CMC）等各种防腐保护剂，探究防腐剂对竹材的防腐能力、抗流失性的影响[6-8]。然而，这些防腐剂也存在一定问题，例如：抗流失性差，成本高，性能不稳定等[9]。现今生活中竹制品和木制品已逐步被塑料制品所取代，而塑料制品存在难降解，一次性使用等问题，给环境带来了很大压力，因此竹材用于食品包装是不可或缺的。目前，有许多竹制品被应用于食品包装和运输中，例如：蔬菜运输包装的竹筐，家庭食品贮放新鲜鱼、肉、果蔬等临时放置的竹篮，用于传统米糕食品和腌制肉制品的包装等。由于竹制品对防腐剂以及其它添加剂有特殊要求，因此大都不添加防腐剂，导致经常出现发霉现象。竹材中富含糖和淀粉，当竹材用来包装水分含量高的食品时，其容易吸收水分，导致食品在存放过程中会引起竹材自身的霉变，反而污染所包装的食品，因此提高食品接触竹材的防腐能力，有助于提高竹材市场的销售。一般来说，食品添加剂都可以添加于食品包装材料和食品接触材料中，因此食品添加剂也可以应用于竹材的防腐中。很多食品防腐剂由于分子质量小，容易流失，在竹制品上难以达到有较持久的防腐效果。

壳聚糖[10-11]是大分子天然物质，也是食品防腐剂。高分子壳聚糖不溶于水，当使用添加少量醋酸的水溶液溶解并调节pH 值至中性后，高分子壳聚糖呈不溶于水的状态，与竹制品中的纤维素等结合，不容易流失。壳聚糖主要来自虾蟹外壳，是自然界产量丰富的有机物，也是一种可再生的天然高分子材料[12]，具有良好的生物相容性及可降解性，并具有一定的抑菌效果[13-15]。壳聚糖本身无毒、无害，可用于食品，其分子结构与纤维很相近，在竹制品中有潜在的使用价值。本研究分离出引起竹材发霉的菌株，选取不同质量浓度的高分子壳聚糖溶液，通过常温、沸水、超声浸泡渗入竹材，接种分离纯化的真菌，做防腐效果试验。测定不同温度处理后，高分子壳聚糖溶液黏度的变化，从而了解壳聚糖的降解情况。期望利用壳聚糖作为竹材防腐剂，应用于未来的食品包装和接触材料中。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

竹材，购自浙江金华竹家园，切成3 cm 长度。

培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）：马铃薯浸出粉10.0 g，葡萄糖20.0 g，琼脂13.0 g，氯霉素0.1 g，蒸馏水1 000 mL；马铃薯葡萄糖水（PDB）：PDA培养基不加琼脂。

高分子壳聚糖（黏度50～800 mPa·s），国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器及设备

DK-8D 恒温水浴锅，上海沪南科学仪器联营厂；LRH-150-S 恒温恒湿培养箱，西安信恒检测仪器有限公司；SHZ-82 振荡器，国华企业；YXQSG46-280S 高压灭菌锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；0.6-0.7 乌氏粘度计，杭州禾德化工仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 发霉竹材中4 种菌的分离 竹材放置在潮湿的环境下使其发霉，从病部取真菌于PDA 培养基，30 ℃培养7 d，平板划线分离纯化3 次后待用。

1.3.2 壳聚糖质量浓度和浸泡方法对竹材的防腐效果的影响 配制质量浓度分别为0，2，5，8，10 mg/mL 的高分子壳聚糖（均含有0.5%冰乙酸）溶液，放入竹材后，分别在常温〔（25±1） ℃）〕、沸水（100 ℃）及超声（160 W，40 ℃）条件下浸泡。处理72 h 后用无菌水冲洗表面10 遍，放入已灭菌且底部放有无菌滤纸的培养皿中，加入20 mL 无菌水，反接种于发霉竹材上的真菌（4 种分离菌株等比例混合），30 ℃恒温培养7 d，观察真菌生长情况，筛选出最佳处理方式和适宜的质量浓度。未经任何处理竹片作为对照1，用水按照上述处理作为对照2。测定每根竹材的菌落数。

1.3.3 竹材不同温度和时间处理对壳聚糖溶液黏度的影响 取5 mg/mL 壳聚糖溶液400 mL，加入600 根竹材，分别置于常温和40，60，80，100 ℃条件下水浴处理，于0，12，24，36，48，60，72 h 取样，用乌氏粘度计测定溶液黏度变化。另取5 mg/mL壳聚糖溶液100 mL，不添加竹片，分别在常温，40，60，80，100 ℃水浴处理72 h，测其黏度（mPa·s），为对照组。另设5 组处理见表1。

表1 试验设计Table 1 Design of experiments

1.3.4 热处理壳聚糖的抑菌试验 5 mg/mL 壳聚糖溶液经过常温，40，60，80，100 ℃水浴72 h 后，取5 mL 溶液加入5 mL PDB 培养基和100 μL 4种分离的菌液中，30 ℃振荡培养72 h，梯度稀释后计算菌落总数。ck1 为无菌水，ck2 为0.5%冰乙酸。

1.4 数据处理

采用Excel 2007 软件对数据进行统计分析。利用Excel 2007 软件作图，图表中数据为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 发霉竹材中4 种菌的分离

挑取竹片上的真菌，在PDA 培养基上划线3次，出现4 种形态的菌落，分别纯化得到图1所示4 株菌株。

2.2 壳聚糖处理对竹材的防腐效果的影响

未经任何处理的空白组竹材的菌落最多，竹材用水、冰乙酸、壳聚糖浸泡，冲洗后接种真菌，在极大程度上减少了菌落数。可能是因为竹材经过浸泡，其营养物质减少，真菌生长较少。如图2所示，壳聚糖浸泡处理可以增加抑菌效果，且随着壳聚糖质量浓度的增加其抑菌效果逐渐增强。常温下，10 mg/mL 壳聚糖处理7 d，竹材菌落数量为10 CFU，表明在同一浸渍时间条件下，竹材的抑菌效果随着壳聚糖质量浓度的增加而增加[16]。由图3可知，100 ℃水浴条件下，2 mg/mL 壳聚糖处理7 d，竹材菌落数量为8 CFU；8 mg/mL 壳聚糖处理7，竹材菌落数量仅为2 CFU。由图4可知，超声条件下，8 mg/mL 壳聚糖处理7 d，竹材真菌数量8 CFU。沸水浴和超声处理的抑菌规律类似常温处理，竹材的菌落数量显著低于常温处理。用水、冰乙酸处理也有很好抑菌作用。可能由于竹材长时间煮沸，进一步促进了营养物质的溶出，菌株生长所必须的营养物质减少，延缓了竹材上菌株的生长，降低了霉变率[17]。结果表明，壳聚糖沸水浴浸泡的防腐效果，优于超声辅助浸泡和常温浸泡。

图1 4 株菌株菌落形态Fig.1 Colony morphology of 4 strains

图2 壳聚糖常温浸泡72 h 竹材的抗菌效果Fig.2 Antifungal effect of bamboo material soaked by chitosan at ambient temperature for 72 hours

图3 壳聚糖100 ℃浸泡72 h 竹材的抗菌效果Fig.3 Antifungal effect of bamboo material soaked by chitosan at 100 ℃for 72 hours

图4 聚糖超声浸泡72 h 竹材的抗菌效果Fig.4 Antifungal effect of bamboo material soaked by chitosan with ultrasound assisted for 72 hours

2.3 不同处理对壳聚糖溶液黏度变化的影响

处理温度越高，时间越长，溶液黏度越低，说明高分子壳聚糖在高温下降解明显。在0～12 h 之间，黏度下降幅度最大，在此后下降速度减慢，说明壳聚糖分子质量变小后，稳定性增加。常温处理条件下黏度下降最少，80 ℃以上处理时，黏度下降速度和下降量最为明显。在常温，40 ℃和60 ℃条件下，壳聚糖溶液浸泡竹片72 h 后，壳聚糖溶液黏度显著减小，说明壳聚糖可能被竹材吸收，导致溶液中的壳聚糖减少，其黏度较低。而在80 ℃下，是否添加竹材溶液的黏度无显著差异。在100 ℃下，添加竹材的壳聚糖溶液的黏度高于未添加竹材的，可能由于部分壳聚糖被吸入竹材中，在冷却后，测定黏度时，部分竹材中的壳聚糖溶出，比没有添加竹材的溶液黏度高。

如图6所示，所有处理条件下的黏度都下降，说明高分子壳聚糖都存在降解。4 号处理组是常温条件，其黏度下降显著较少，说明高温是壳聚糖降解的主要原因。冰乙酸、竹材对壳聚糖降解速度影响较小。壳聚糖溶液黏度随着温度的升高而降低，这和杨帅等[18]的结果一致。韩怀芬等[19]发现壳聚糖降解是吸热反应，温度升高有利于反应进行，随温度升高，虾、蟹壳聚糖溶液降解速度加快，其黏度下降。

2.4 热处理壳聚糖对菌株的影响

由图7可知，4 种从竹材中分离出来的真菌，添加于经60，80，100 ℃处理72 h 的壳聚糖中，都没有生长。40 ℃处理的壳聚糖抑菌效果优于常温的壳聚糖。热处理会导致高分子壳聚糖降解为低分子壳聚糖，壳聚糖降解后的抑菌能力显著提高。

3 结论

本研究主要探究了壳聚糖的不同处理方式对包装竹材防腐效果的影响。当用沸水浴条件下的壳聚糖处理竹材时，壳聚糖质量浓度为5 mg/mL时，竹片上基本没有真菌生长，大大减少了壳聚糖用量，提高了抑菌效果。且抑菌效果随着溶液温度升高而增加，壳聚糖随着温度的升高，其降解也增加，这造成了壳聚糖资源的浪费。在本试验中，从常温组、40 ℃组和60 ℃组可以看出，壳聚糖发生了明显的吸附；从80 ℃和100 ℃处理组可以看出，壳聚糖发生了明显的降解，壳聚糖降解可以进一步提高抑菌能力。王雅梅等[7]研究发现竹材的防腐和吸药量有关，当温度为60 ℃时，壳聚糖大部分被竹材吸收，随着温度的升高壳聚糖发生了明显的降解，不利于壳聚糖资源的充分利用，因此5 mg/mL 的壳聚糖溶液在60 ℃水中浸泡处理竹材，可以较好的提高竹材的防腐效果。

图5 温度和时间对壳聚糖溶液黏度的影响Fig.5 The effect to treatment temperature and time on chitosan solution viscosity

图6 处理方式和时间对壳聚糖溶液黏度的影响Fig.6 The effect to treatment method and time on chitosan solution viscosity

图7 不同温度处理72 h 的壳聚糖溶液对4 种菌的抑菌效果Fig.7 Inhibition effect of chitosan solution after different temperatures heating for 72 h on four kinds of fungi