叶绿素对ob/ob肥胖小鼠炎症指标的影响

王 潇，欧雅文，李媛媛，张 燕

（中国农业大学食品科学与营养工程学院 国家果蔬加工工程技术研究中心 北京100083）

肥胖是目前危害人体健康的一大慢性疾病，可引起脂质代谢紊乱，如2 型糖尿病、脂肪肝、动脉粥样硬化等，同时也是引起胰岛素抵抗形成的关键因素。肥胖是因能量摄入与消耗不平衡或机体代谢障碍而导致的代谢异常疾病，由于脂肪组织具有参与机体代谢的细胞（如脂肪细胞、肝脏细胞），参与免疫反应的细胞（如巨噬细胞）及丰富的毛细血管网，这种组织结构给机体提供了免疫反应和代谢反应相互作用的适应环境，使这种相互作用尤其对肥胖的发生、发展具有重要作用[1]。

Hotamisligil 等[2]在1993年发现炎症介质——肿瘤坏死因子（TNF-α），在脂肪组织中高效表达，首次认识到炎症与肥胖的关联性。作为一种低水平的慢性炎症反应，引起这种炎症反应的起始部位主要在脂肪组织，尤其是内脏脂肪组织。肥胖引起胰岛素抵抗的主要部位也集中在内脏脂肪组织，由脂肪细胞产生的炎症因子TNF-α、白介素（IL-6）、瘦素（LEP）等均可作为指示炎性标志物[3]。与肥胖相关的慢性炎症通常会出现促炎因子IL-6、TNF-α、瘦素水平明显上升，抗炎因子脂联素、脂肪因子Adipolin 等水平显著下降等表型特征，这些炎症因子能够调节脂肪组织和代谢器官间的相互作用。

叶绿素作为膳食绿色蔬菜中重要的非营养性物质，广泛存在于叶绿体类囊体膜上。国内外研究表明，叶绿素具有缓解肥胖，抗氧化，调节糖脂代谢等作用[4-6]，然而，叶绿素对炎症的影响鲜有研究。由于肥胖会伴随脂肪组织细胞内炎症信号通路的激活、炎性细胞因子的释放等，因此对炎症的干预可能是研究肥胖及其它代谢问题的基础。本研究通过对肥胖小鼠进行为期1 个月的灌胃叶绿素饲养，检测其炎症、肥胖基础指标，探究叶绿素对炎症的影响，从而进一步了解叶绿素发挥的生物活性作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新鲜菠菜（Spinacia oleracea L.），中国农业大学家属区农贸市场。

8 周龄ob/ob 小鼠，北京华阜康生物科技股份有限公司。动物生产许可证号SCXK（京）2012-0001。

高脂饲料（Research Diets D12492，251 kJ），美国Research Diets 公司。

1.2 主要试剂

链霉亲和素、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、内毒素（ET）、瘦素（LEP）、脂联素（ADPN）、ELISA 试剂盒，上海朗顿生物科技有限公司。

1.3 试验仪器

JYDZ-31B 九阳打浆机，九阳股份有限公司；CR21GⅢ型高速冷冻离心机，日本日立公司；DHP-9082 电热恒温培养箱，廊坊市中仪国科仪器仪表有限公司；Epoch Acquit 超微量微孔板分光光度计，美国Biotek 公司；Acquity UPLC 血糖仪，三诺安稳传感有限公司；Multiskan MK3 型酶标仪，美国Thermo 公司。

1.4 试验方法

1.4.1 叶绿素的制备 参照Rivera-Chávez 等[7]的方法提取新鲜菠菜中的叶绿素。将洗净晾干的菠菜叶去梗，置于搅拌机内并倒入适量乙醇（料液比1∶3），搅拌成浆。4 ℃，8 000 r/min 离心6 min，所得上清液在36 ℃水浴条件下旋转真空蒸发浓缩，获得叶绿素浓浆，测定叶绿素浓度。移液枪吸取1 mL 叶绿素浓缩液，梯度稀释100 倍后分别在波长645，663 nm 处测吸光度值，以80%（体积分数）丙酮为对照。叶绿素水平按式（1）～式（3）计算。

本试验中，得到叶绿素溶液平均质量浓度为7 mg/mL。

1.4.2 实验动物饲养及分组 小鼠均饲养于室温（23±2）℃，湿度（50±5）%，12 h∶12 h 光暗周期下，自由进食饮水。适应性饲养7 d 后，按体重随机分成对照组（NCD）、高脂饮食组（HFD）和叶绿素干预组（CHL），每组6 只，并分笼饲养，分组方式如表1所示。各组小鼠连续灌胃4 周，每日灌胃2 次（灌胃饮用水、浓缩叶绿素液以1 mL/100 g 计算），记录小鼠每日体重。

表1 实验动物分组Table 1 Experiment design and different treatments

1.4.3 摄食量和空腹血糖的测定 每次检测24 h 摄食量，适应性饲养期间测1 次，给药期间测4次（每周1 次）。共测5 次。

测定空腹血糖前要求ob/ob 小鼠禁食24 h，剪尾取血测空腹血糖值。比较ob/ob 鼠血糖值，判断ob/ob 肥胖小鼠模型是否成功。每周测1 次空腹血糖。

1.4.4 血清中炎症因子和血清内毒素的测定 将20 倍浓缩洗涤液用蒸馏水稀释20 倍后备用。小心揭开封板膜，弃去液体甩干，每孔加满洗涤液静置30 s 后弃去，重复5 次，拍干。每孔先加入显色剂A，后加入显色剂B，轻轻振荡混匀，37 ℃避光显色10 min（待测样品孔混匀于37 ℃温育60 min后显色）。加终止液使反应终止（此时蓝色立转黄色）。以空白孔调零，在加入终止液10 min 内，测定450 nm 波长处各孔的吸光度（OD 值）。以标准品的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标做标准曲线。

将各种试剂移至室温平衡至少30 min，试剂加样量见表2。

表2 不同处理组的添加剂量Table 2 Different treatments of dosages

1.4.5 数据统计与分析 每个试验至少重复3次，采用SPSS Statistics 17 单因素方差分析（ANOVA） 模块进行差异显著性检验，P＜0.05 时，表示差异显著。采用Origin 9.0（Microcal Software，Inc.，Northampton USA）统计数据并制图。

2 结果与分析

2.1 叶绿素对ob/ob 小鼠血糖、体重及摄食量的影响

表3为不同试验组小鼠在饲养时间内血糖水平、体重及摄食量的变化。由表3可知HFD 组、CHL 组较NCD 组小鼠的血糖水平、体重及摄食量显著上升（P＜0.05），说明高脂饮食促进小鼠血糖的上升，体重的增加及摄食量的增加，与Krebs等[8]研究结果一致。

在灌胃小鼠叶绿素饲养过程中，HFD 组与CHL 组的3 个指标水平变化无显著性差异（P＞0.05），说明叶绿素对肥胖的干预影响作用可能是一个长期且缓慢的过程，短时间内对血糖、体重及摄食量这类表观指标无显著作用，还需做长期试验。

表3 小鼠血糖、体重、摄食量的变化Table 3 Changes of blood glucose，body weight and food intake in mice

2.2 叶绿素对肥胖小鼠炎症指标的影响

2.2.1 叶绿素对TNF-α、IL-6 的影响 TNF-α、IL-6 是由多种细胞分泌的促炎因子，是反映炎症程度的重要指标。TNF-α 通过激活炎症细胞，上调黏附因子和氧自由基而损害细胞组织[9]；而IL-6则主要由单核细胞在炎症反应诱导下产生，它直接激活炎症细胞，并诱导急性期蛋白的合成，催化并放大炎症反应和毒性作用，造成组织细胞损害[10]。

研究检测不同分组小鼠血清的TNF-α、IL-6水平，并做组间对照，结果如表4所示。HFD 组血清中TNF-α、IL-6 水平较对照组显著提高（P＜0.05），TNF-α 由（124.63±5.96） ng/L 上 升 至（170.57±9.46）ng/L，IL-6 由（110.47±4.12）pg/mL上升至（156.23±8.04） pg/mL，表明高脂饮食会升高血清中IL-6 水平，与Campbell 等[11]相关研究结论一致。而给肥胖小鼠灌胃叶绿素4 周后，小鼠血清中TNF-α、IL-6 水平显著下降（P＜0.05），其中TNF-α 水平由（170.57 ± 9.46）ng/L 降至（148.22±6.33）ng/L，IL-6 水平由（156.23±8.04）pg/mL 降至（135.83±5.03）pg/mL，表明叶绿素能有效降低高脂饮食下肥胖小鼠血清中TNF-α、IL-6 水平。因此，叶绿素可能对肥胖中的炎症调节有积极影响。

表4 血清中TNF-α、IL-6 水平Table 4 The level of TNF-α and IL-6 in serum

2.2.2 叶绿素对血清内毒素的影响 内毒素（ET）被认为是肥胖者体内全身炎症级联反应的信号因子，可由肠道菌群代谢释放。当人体长期处于高脂高糖饮食条件下，肠道菌群会产生较多内毒素。当体内ET 水平上升时，导致肠壁上皮细胞闭合蛋白表达减少，肠壁通透性增强[12]，ET 可突破肠道屏障由肠道进入血液，引起内毒素血症等多种疾病。另外，ET 还能够活化天然免疫受体（TLR4），介导LPS 诱导炎症反应，引起慢性亚临床炎症，导致肥胖及胰岛素抵抗。ET 刺激肥胖者全血细胞产生TNF-α、IL-6 等促炎因子，诱导炎症反应的初始环节[13]。图1为叶绿素对内毒素的影响，不同试验组之间有显著性差异。

HFD 组较NCD 组小鼠的血清中ET 浓度显著升高（P＜0.05），说明高脂饮食会显著造成小鼠血清中ET 浓度的上升，与Saad 等[12]的研究结果一致。给小鼠灌胃叶绿素4 周后，叶绿素干预了高脂饮食造成的ET 浓度的上升。同时，在此基础上，可能ET 浓度下降使得由ET 刺激细胞因子而产生的TNF-α、IL-6 水平也相应下降。Chang 等[14]用灵芝多糖水提物灌胃高脂饮食诱导的肥胖小鼠，发现灵芝多糖水提物能显著降低变形菌门的相对丰度，从而减轻炎症，缓解肥胖。有关叶绿素对肠道菌群的影响研究表明，叶绿素进入小鼠体内可显著降低变形菌门（Proteobacteria）的相对丰度，产生大量脂多糖[15]。因此，推测叶绿素通过降低变形菌门的相对丰度，而显著降低血清中内毒素的含量。

2.2.3 叶绿素对瘦素（LEP）的影响 瘦素（LEP）由脂肪细胞分泌，在调节机体能量平衡，促进免疫和防治人类心血管疾病等生理、病理等多个方面发挥重要作用[16]。在生物体中，瘦素通常会受多种因素影响，如胰岛素、糖皮质激素和TNF-α 等都会影响其表达和分泌。当机体触发炎症反应时，体内的LEP 水平升高，相关免疫因子表达增加[17]。

本试验检测了不同试验组小鼠血清的LEP水平，如图2所示，HFD 组与NCD 组比较，血清中LEP 浓度显著升高（P＜0.05）。在上述结果中，研究发现小鼠血清中TNF-α 水平显著上升，而TNF-α会促进LEP 的表达和分泌，因此小鼠血清中LEP水平的上升可能与TNF-α 水平上升有关。

ob/ob 小鼠叶绿素灌胃干预4 周后，CHL 组和NCD 组较HFD 组小鼠血清中LEP 水平下降（P＜0.05），说明叶绿素抑制了LEP 的表达与分泌。研究发现乳酸杆菌能显著降低瘦素水平[18]。由于叶绿素可以显著升高肠道菌群中乳酸菌属的相对丰度，因此瘦素水平下降与乳酸菌属的丰度相关[15]。

2.2.4 叶绿素对脂联素（ADPN）的影响 图3表示小鼠血清中脂联素（ADPN）质量浓度的变化。从图中可以看出，与NCD 组相比，HFD 组及CHL 组小鼠血清的ADPN 水平均显著下降（P＜0.05）。ADPN 作为脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性多肽，是胰岛素增敏激素，可改善胰岛素抵抗和动脉粥样硬化等[19]。同时，ADPN 水平还可预测2 型糖尿病、冠心病的发展，目前临床研究发现ADPN具有抗炎症作用[20]。本研究中CHL 组给ob/ob 小鼠灌胃叶绿素4 周，与HFD 组ob/ob 小鼠相比，叶绿素抑制了由高脂饮食引起的ADPN 水平的下降，有利于降低炎症的发生。

图1 叶绿素对小鼠血清内毒素的影响Fig.1 Effects of chlorophyll on serum endotoxin in mice

图2 叶绿素对小鼠血清LEP 的影响Fig.2 Effects of chlorophyll on serum leptin in mice

图3 叶绿素对小鼠血清ADPN 的影响Fig.3 Effects of chlorophyll on serum adiponectin in mice

3 结论

高脂饮食促进小鼠血清中TNF-α、IL-6、LEP促炎因子和内毒素分泌，抑制ADPN 水平下降；而叶绿素通过抑制体内促炎因子与内毒素水平升高，促进ADPN 水平升高，推测叶绿素可能通过降低炎症因子水平进而影响肥胖的发生及发展。由于炎症因子与肠道菌群密切相关，因此肠道菌群结构变化与炎症因子水平的相关性，仍需进一步探究，从而为叶绿素干预肥胖的作用机制提供依据。