裂谷热病毒Gn 蛋白主要抗原区的串联表达和多克隆抗体制备

恽佳蕾，李文良，毛 立，杨蕾蕾，孙 敏，张纹纹，刘茂军

（1.江苏省农业科学院兽医研究所，农业农村部兽用生物制品工程技术重点实验室，江苏省食品质量安全重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地，江苏南京 210014；2.江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江 212013）

裂谷热（Rift Valley fever，RVF）是由裂谷热病毒（Rift Valley fever virus，RVFV）引起的一种人兽共患传染病。蚊虫是其重要的传播媒介，易感动物可通过接触发病或感染动物的体液、血液、排泄物和分泌物等被感染[1]。该病的主要感染对象为反刍动物，可导致反刍动物流涕、厌食、腹泻、高热等症状，犊牛和羔羊的病死率可达90%。同时，若母畜感染，流产概率可高达80%～90%。人类对该病同样易感，严重情况下可导致致命性出血热[2-3]。自发现之日起，由RVFV 引起的疫情不断发生[4]。起初该病仅在非洲撒哈拉以南地区出现，随后（1977—1978 年）在非洲东北部的埃及暴发，造成大规模人类感染，18 000 多个报道病例中约有600 人死亡；2000 年，也门、阿拉伯半岛和中东地区也暴发了RVF 疫情[5]；2016 年，我国出现首例输入性RVF 确诊病例[6]。

RVFV 属于布尼亚病毒科（Bunyaviridae）白蛉病毒属（Phlebovirus）[7]，具有典型的布尼亚病毒特性。RVFV 基因组为单股负链RNA，可分为L（大）、M（中）、S（小）3 个节段，其中：S 节段采取双义编码方式，编码核蛋白N 和非结构蛋白NSs；M 节段编码两种囊膜糖蛋白（Gc 和Gn），以及NSm 和未知功能的结构蛋白；L 节段编码RNA 依赖的RNA 聚合酶[8-10]。囊膜糖蛋白对于布尼亚病毒在高尔基体的成熟具有重要作用，Gc 和Gn 蛋白参与高尔基体的定位过程，而病毒表面的Gc 和Gn 蛋白含有中和表位，也可刺激机体产生抗体，是病毒的主要免疫原结构蛋白[11-12]。国内已有研究[3，13-16]通过不同的表达系统对Gn 或Gc 蛋白进行表达，但此类研究多采用真核表达系统，虽有研究对其主要抗原片段进行原核表达，但并未开展深入鉴定与检测。

本研究通过分析Gn 蛋白抗原位点分布情况，选取RVFV Gn 两个主要抗原区域基因片段进行串联，构建原核表达质粒，转化至BL21 感受态细胞，经IPTG 诱导表达后鉴定重组蛋白的表达情况，进而用重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体并鉴定多抗的反应性，以期为后续Gn 蛋白的免疫学功能研究和RVFV 检测方法建立奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试剂

质粒提取试剂盒，购自Axygen 公司；HRP标记的羊抗小鼠IgG、His 标签单抗、蛋白质Marker，购自北京全式金生物技术有限公司；大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，购自南京擎科生物科技有限公司；DAB 显色试剂盒，购自武汉博士德生物工程有限公司；转染试剂Lipofectamine 2000，购自Invitrogen 公司；免疫染色固定液、封闭液、抗体稀释液、DAPI、flag 标签单抗和Alexa Fluor 555 标记驴抗小鼠IgG，购自碧云天生物技术研究所。其他试剂均为国产或进口分析纯。

1.2 质粒构建

根据Genbank 中公布的RVFV ZH501 株基因组信息（DQ380200），通过DNAstar Protean 软件分析蛋白抗原性。选取两个主要抗原区域（1～265 aa 和297～411 aa，图1），由南京钟鼎生物技术有限公司合成这两个区域的串联基因片段，通过EcoR I 和XhoI 酶切位点克隆至原核表达载体pET-28a（+），获得重组质粒pET-28-Gn。同时，由南京擎科生物科技有限公司合成完整的Gn基因，通过EcoR I 和BamH I 酶切位点克隆至载体p3×flagcmv-14，获得重组质粒p14-Gn。重组质粒通过双酶切和测序鉴定正确。

图1 Gn 蛋白主要抗原区分析选择

1.3 目的蛋白诱导表达及表达形式分析

将重组质粒pET-28-Gn 转化至BL21 感受态细胞，随后涂布于LB 琼脂平板（含50 μg/mL 卡那霉素），37 ℃过夜培养；挑取单菌落于LB 培养液中，37 ℃震荡培养过夜，按1:100 比例接种于新鲜LB 培养液中，37 ℃震荡培养2 h；待OD600为0.6～0.8 时加入终浓度为0.5 mmol/L 的IPTG，进行诱导表达，5 h 后收集菌液；将诱导后的菌液离心、取沉淀，加入原菌液1/10 体积的PBS 重悬，然后置于冰上进行超声破碎直至菌液澄清，离心分离上清及沉淀（包涵体）。分别取诱导前后以及超声后的上清和沉淀样品，加入SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液（5×）煮沸10 min，用12% SDS-PAGE 分离胶分析鉴定目的蛋白表达情况与表达形式。

1.4 蛋白诱导表达条件优化

1.4.1 诱导浓度优化 按照上述方法接种菌液，震荡培养至OD600为0.6～0.8 时，分别加入终浓度为0.10、0.25、0.50、0.75、1.00 mmol/L 的IPTG，37 ℃震荡培养5 h 后，离心收集菌体，加入蛋白上样缓冲液煮沸，进行SDS-PAGE，分析确定最佳诱导浓度。

1.4.2 诱导时间优化 按照上述方法接种菌液，震荡培养至OD600为0.6～0.8 时，加入终浓度为0.50 mmol/L 的IPTG，37 ℃分别震荡培养2、3、4、5、6 h 后，离心收集菌体，加入蛋白上样缓冲液煮沸，进行SDS-PAGE，确定最佳诱导时间。

1.5 Western Blot 检测

蛋白样品经SDS-PAGE 电泳后，使用半干法转印至硝酸纤维素膜，随后将膜放入新鲜配制的5%脱脂乳中，37 ℃封闭2 h；使用PBST 洗涤3次，加入1:1 000 稀释的抗His 标签鼠源单抗，37 ℃孵育2 h；使用PBST 洗涤3 次，加入1:4 000 稀释的HRP 标记羊抗小鼠IgG，37 ℃孵育2 h；使用PBST 洗涤3 次后，进行DAB 显色。

1.6 多克隆抗体制备与鉴定

按照最佳诱导条件表达重组蛋白，分离包涵体。用原菌液体积1/10 的含8 mol/L 尿素的PBS 4 ℃溶解过夜，10 000 r/min 离心5 min，吸取上清测定蛋白浓度后与ISA 201 佐剂混合乳化（蛋白终浓度为500 µg/mL），免疫6 周龄雌性BALB/c 小鼠。采用背部皮下多点注射免疫，每只100 µg/次。每次免疫间隔2 周，共免疫3 次。免疫后采血分离血清，使用间接ELISA、Western Blot 和间接免疫荧光试验（IFA）检测小鼠抗体滴度与反应性。

1.7 间接ELISA

用碳酸盐包被缓冲液稀释重组Gn 蛋白至1 μg/mL，ELISA 检测板每孔包被100 μL，4 ℃过夜；PBST 洗涤3 次，每孔加入200 μL 含0.5%BSA 的PBST，置于37 ℃中封闭2 h；PBST 洗涤3 次，加入倍比稀释的免疫血清（1:100～1:51 200）和阴性对照血清，37 ℃孵育1 h；PBST 洗涤3 次，分别加入1:4 000 稀释的HRP 羊抗小鼠IgG 二抗，37 ℃孵育1 h；PBST 洗涤3 次，以TMB 底物液避光显色10 min，加入2 mol/L 硫酸终止，用酶标仪测定OD450，计算抗体滴度。

1.8 间接免疫荧光试验（IFA）

将293T 细胞接种于24 孔细胞培养板，当细胞达到80%融合度时进行转染。按照说明书制备质粒p14-Gn 与脂质体的混合物，静置5 min 后加入细胞孔；转染24 h 后，弃去培养液，加入免疫染色固定液固定细胞15 min，然后加入封闭液37 ℃孵育1 h；加入1:1 000 稀释的flag 抗体或制备的多抗，37 ℃孵育1 h；洗涤后加入1:500 稀释的Alexa Fluor 555 标记的驴抗小鼠IgG，37 ℃孵育30 min，DAPI 染色5 min；PBS 洗涤3 次后，置于荧光显微镜下观察。

2 结果

2.1 目的蛋白诱导表达

重组质粒转化至BL21 感受态细胞中，使用IPTG 诱导表达后，对表达产物进行SDS-PAGE 鉴定。结果（图2）显示，在45 kDa 处有符合预期大小的目的条带出现，表明Gn蛋白正确表达。同时，经过超声破碎的菌液沉淀（包涵体）中目的条带明显，而上清中条带很淡，说明蛋白主要存在于包涵体中。

图2 Gn 蛋白诱导表达及表达形式的SDS-PAGE 分析结果

2.2 表达条件优化

加入终浓度分别为0.10、0.25、0.50、0.75、1.00 mmol/L 的IPTG 进行诱导表达。SDS-PAGE结果（图3）显示，Gn 蛋白的最佳诱导浓度为0.25 mmol/L。分别诱导2、3、4、5、6 h 后，收集菌体样品进行SDS-PAGE 鉴定。结果（图4）显示，Gn 蛋白的最佳诱导时间为5 h。

图3 不同诱导浓度Gn 蛋白表达的SDS-PAGE 分析结果

图4 不同诱导时间Gn 蛋白表达的SDS-PAGE 分析结果

2.3 重组蛋白Western Blot 鉴定

蛋白样品经SDS-PAGE 并转印至硝酸纤维素膜后，使用抗His 标签鼠源单抗作为一抗检测重组蛋白反应性。结果（图5）显示，诱导表达的菌液在45 kDa 处出现与目的蛋白大小一致的条带，而对照样品未出现条带。

图5 Gn 重组蛋白Western Blot 鉴定结果

2.4 ELISA、Western Blot 和IFA 鉴定多克隆抗体反应性

免疫小鼠3 次后，分离鼠血清并通过间接ELISA 检测血清抗体滴度。结果显示，重组蛋白免疫可诱导产生高水平抗体，抗体滴度可达1:51 200以上。进一步通过Western Blot 检测多克隆抗体的反应性。结果（图6）显示，制备的多克隆抗体与目的蛋白有良好的反应性，检测到分子量大小约为45 kDa 的蛋白条带。

图6 Western Blot 检测Gn 多克隆抗体反应性结果

将表达Gn 蛋白的真核表达质粒p14-Gn 转染293T 细胞，转染24 h 后固定细胞，采用IFA 检测多克隆抗体的反应性。结果（图7）显示，制备的多克隆抗体可与细胞中表达的Gn 蛋白反应，在胞浆中呈现特异的红色荧光，与flag抗体检测结果一致。

图7 IFA 检测Gn 多克隆抗体的反应性结果

3 讨论

RVF 主要经蚊媒传播，但不能排除其通过气候转移、游客携带或食物链向欧洲、亚洲或美洲地区传播的可能性[17-18]。随着全球化推进、各国间经济交流以及动物产品进出口贸易的频繁，RVFV 传入我国的风险日益增加。2016 年7 月，我国出现首例输入性RVF 病例[6]。因而需要建立简便特异的检测技术，做好技术储备，并加强检疫，防范该病传入。

RVFV 囊膜蛋白Gc 和Gn 是病毒的保护性抗原，可诱导机体产生中和抗体，能作为疫苗和检测方法研究的靶抗原。目前，我国已有研究[3，13-15]通过大肠杆菌或杆状病毒表达系统表达Gn 和Gc，但对表达蛋白及诱导抗体缺乏进一步鉴定。夏鹏等[3]对Gn 蛋白的两个优势抗原片段分别使用pCold I载体表达，发现蛋白以包涵体形式存在，但未对其进行深入鉴定和应用。国外已有研究[19]，利用原核表达的囊膜蛋白制备单抗并用于病毒检测，这提示原核表达系统也可用于囊膜蛋白的表达及检测方法研究。真核表达系统虽然可以获得接近天然结构的蛋白，但表达量较低，纯化难度大，成本也较高。原核表达系统可以更加高效、简便地获得高纯度、高含量的重组蛋白。因此，为获得原核表达的Gn 重组蛋白并检验其抗原性，以用于建立RVF 检测方法和制备单抗等后续研究，本试验首先通过DNAstar 软件分析蛋白抗原性，结合在线分析结果（德泰生物在线分析工具），分别选取抗原性较好的两个区域（1～265 aa 和297～411 aa 区域），将对应序列拼接后进行基因合成，构建串联表达载体，转化至BL21 感受态细胞进行重组Gn 蛋白表达。经鉴定表达产物主要以包涵体形式存在，上清中仅有少量表达。将表达的重组Gn 蛋白免疫小鼠，收集血清后进行ELISA 检测，发现多抗血清效价可达1:51 200 以上。Western Blot 检测显示，制备的Gn 多克隆抗体能与重组蛋白产生特异性反应，说明所表达蛋白可诱导产生良好的体液免疫反应，具有良好的免疫原性。由于Gn 是RVFV 的囊膜蛋白，具有翻译后的修饰和空间构象，因此为了后续的单抗制备和检测方法研究，必须检测制备的多克隆抗体与天然病毒蛋白的反应性。但由于缺乏可用的毒株以及生物安全条件限制，本研究构建了表达完整Gn 蛋白的真核表达质粒（融合flag 标签），转染293T 细胞模拟真实的病毒蛋白，通过flag 标签抗体和制备的多抗分别进行IFA 检测，结果发现在胞浆中均呈现特异的红色荧光，表明制备的重组蛋白可诱导与天然病毒蛋白相似的抗体反应，制备的多克隆抗体有望与天然病毒蛋白产生反应，因此制备的重组蛋白及多克隆抗体为以后Gn 蛋白免疫学功能研究和RVFV 检测方法的建立奠定了基础。