固相萃取-高效液相色谱-串联质谱联用法快速测定中药材猴耳环中47 种农药残留

李 纯, 熊 颖, 顾利红, 侯惠婵, 栗建明

(广州市药品检验所，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，广州 510160)

中药材猴耳环Folium Archidendri 为豆科植物猴耳环Archidendron clypearia (Jack.) Nielsen 的干燥叶[1]，具有抗真菌、抗病毒、抗炎、抗过敏、抗肿瘤、抗胃溃疡和抗结核等药理作用[2]。目前，对猴耳环的研究多集中在品种归属、化学成分分离与药理作用[3-5]，尚未见关于其农药残留的报道。本课题组在调研过程中发现，在猴耳环种植过程中存在使用未登记农药现象，对其农药残留处于监管盲区，导致其使用存在安全隐患。鉴于此，本研究选择47 种农药进行筛查，包括：①课题组实地调查中发现种植过程中使用过的农药；②《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》) 2020年版通则“农药多残留检测法 第五法 药材与饮片(植物类) 中禁用农药多残留测定法”中收录的部分禁用农药及农药代谢物[6]；③适用于高效液相色谱-质谱联用仪检测的农药。根据猴耳环基质的特点，采用乙腈提取、HLB 固相萃取柱净化的前处理方式，建立了一种简便、快速、稳定性好的农药多残留快速筛查方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与药剂

3200 QTRAP 质谱联用仪 (美国 ABsciex 公司，分析软件Analyst 1.6.3)；1200 高效液相色谱仪 (美国 Agilent 公司)；AG245 和 XP-26 电子分析天平 (瑞士 Mettler Toledo 公司)；Maxi MixⅡ涡旋混合器 (美国Thermo 公司)；ST-16 高速匀浆仪(德国 IKA 公司)；Milli-Q 超纯水制备系统 (美国MilliQ 公司)。

47 种农药标准品 (表 1) 包括 45 种液体 (浓度均为1 000 mg/L) 及苯线磷砜和涕灭威砜2 种固体(纯度≥98%)，德国 Dr. Ehrenstorfer GmbH 公司；乙腈和丙酮 (色谱纯)，德国Merck 公司；醋酸(色谱纯)、乙酸氨 (色谱纯) 和氯化钠 (分析纯)，上海安普科技有限公司；Oasis 亲水亲油平衡材料(HLB) 固相萃取柱 (规格200 mg，6 mL)，美国Waters 公司；20 批次猴耳环样品由广州莱泰制药有限公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理 将猴耳环样品粉碎，过三号筛后，称取5 g (精确到0.01 g) 于50 mL 聚苯乙烯聚塞离心管中，加入1 g 氯化钠，混匀，加入20 mL 乙腈，于8 000 r/min 下匀浆提取20 min，于3 500 r/min下离心5 min；收集上清液，重复提取两次；合并上清液，于40 ℃水浴浓缩至3～5 mL，用1～2 mL乙腈多次洗涤并转移至10 mL 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀，于3 500 r/min 下离心3 min；取3 mL 上清液，过HLB 固相萃取柱 (无需活化，直接上样过柱)，收集全部净化液，混匀，待测。农药空白猴耳环基质同法制备。

1.2.2 高效液相色谱-串联质谱检测条件

色谱条件：菲罗门Kinetex C18色谱柱(100 mm × 2.1 mm, 2.6 μm) 及预保护柱 (4 mm ×2.0 mm，2.6 μm)；流动相 A 相为 95% 乙腈 (含5 mmol/L 甲酸铵和 0.1% 甲酸)，B 相为水 (含5 mmol/L 甲酸铵和0.1%甲酸)。梯度洗脱程序：0～1 min，30%A；＞1～12 min，30%→100%A；＞12～14 min，100%A；＞14～15 min，100%→30%A；＞15～20 min，30%A。流速 0.3 mL/min；柱温40 ℃；样品盘温度20 ℃。进样体积2 μL。

质谱条件：电喷雾离子源正离子扫描模式(ESI+)，依赖保留时间的多反应监测模式 (scheduled MRM)，检测窗60 s。气帘气 (CUR) 0.01 MPa，碰撞气 (CAD) 0.06 MPa，喷雾电压 (IS) 5 500 V，离子化温度 (TEM) 600 ℃，雾化气 (GS1) 与辅助气(GS2) 均为0.35 MPa。47 种农药保留时间及高效液相色谱-串联质谱参数见表1。

1.2.3 标准溶液配制及标准曲线绘制

农药单一标准溶液：分别准确吸取45 种液态农药标准品溶液 (1 000 mg/L) 1.0 mL，用丙酮稀释，配制成质量浓度为100 μg/mL 的农药单一标准储备液；准确称取苯线磷砜和涕灭威砜2 种固态农药标准品5 mg (精确至0.001 mg)，用丙酮溶解，配制成质量浓度为100 μg/mL 的农药单一标准储备液。所有储备液均于 −30 ℃保存。

农药混合标准溶液：移取一定体积的47 种农药单一标准储备液，用乙腈稀释，配制成农药混合标准溶液 (表 2)，于 −30 ℃ 保存。

基质匹配混合标准工作溶液：取1 mL 猴耳环

空白基质溶液，采用氮吹浓缩至约0.5 mL，分别加入农药混合标准溶液10、20、50、100、150 和200 μL，用乙腈稀释并定容至1 mL，配制成系列质量浓度的基质匹配混合标准工作溶液，现配现用。

表1 47 种农药的保留时间及质谱参数Table 1 Retention time and HPLC-MS/MS detection parameters of 47 pesticides

表2 47 种农药的线性范围、相关系数、定量限、添加回收率及相对标准偏差Table 2 Linear range, r, LOQ, recoveries and RSDs of 47 pesticides

分别量取基质匹配混合标准工作溶液及经1.2.1 节处理的样品溶液各1 mL，加入0.1 mL水，混匀，过0.22 μm 微孔滤膜，按1.2.2 节的条件测定，以各农药的质量浓度 (x) 为横坐标，以各农药的定量离子峰的峰面积响应值 (y) 为纵坐标，绘制校正曲线，权重系数选择1/x，得到47 种农药的回归方程及相关系数。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

采用农药单一标准溶液进行质谱扫描获取离子对信息，根据响应值优化碰撞电压、去簇电压等参数，每个待测物筛选出2～4 组特征离子对。根据猴耳环基质特点，每种农药选择2 组响应值高且干扰少的特征离子对作为监测离子对，其中丰度最高的选为定量离子对，所有离子对均为定性离子。选择依赖保留时间的多反应监测模式，在化合物保留时间 ± 30 s 内扫描，获得准确的定性及定量结果，优化后的结果见表1。

根据《中国药典》[6]进行样品测定时，如果检出的色谱峰保留时间与对照品一致，且离子丰度比与对照品的离子丰度比一致 (相对丰度＞50%，允许 ± 10%偏差；相对丰度＞20%～50%，允许 ± 15%偏差；相对丰度＞10%～20%，允许 ± 20%偏差；相对丰度 ≤ 10%，允许 ± 50%偏差)，则可判定为检出。优化后的质谱参数见表1，典型色谱图见图1。

2.2 样品前处理条件的优化

猴耳环药用部位为干燥叶，含水量低 (低于8%)，且含较多叶绿素、纤维等[1]。考虑到方法的通用性及便捷性，采用乙腈匀浆提取制备原液，但原液浑浊，呈深绿色，超过50%的检测指标回收率低于50%，基质干扰大，需要净化。HLB 是由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物，保留机理为反相，适用于pH 值范围较宽的多种分析物。HLB 固相萃取柱与乙腈提取液联合使用时无需活化，直接过柱，操作简单，大大降低了试验难度。结果表明，经HLB 固相萃取柱净化后，80%以上的待测物回收率在70%～120%之间。

2.3 基质效应

本研究采用绝对法评价基质效应 (Me)[7-11]，当Me在85%～115%时，基质效应在可控范围，基质效应对结果的影响可忽略，当Me＞115%或＜85%时，基质效应对结果的影响表现为抑制或增强效应，应对测得值进行校正[9]。结果显示，有41 种农药的Me在85%～115%之间，表明其影响可忽略不计；而甲胺磷受基质严重抑制影响 (Me＜50%)，氧化乐果、吡虫啉、涕灭威亚砜和多菌灵受基质轻度抑制影响 (60%＜Me＜85%)，敌百虫受基质轻度增强影响 (Me＞ 115%)。因此，本研究采用基质匹配标准溶液进行校正。

2.4 方法线性范围、灵敏度、准确度及精密度

结果 (表2) 显示，47 种农药在各自的线性范围内，其质量浓度与对应的峰面积间均呈良好的线性关系 (r＞0.992 0)。以10 倍信噪比的最低添加水平确定其定量限 (LOQ) 为0.001～0.015 mg/kg。在LOQ、5 倍 LOQ、20 倍LOQ 3 个添加水平下，47 种农药在猴耳环中的平均回收率在54%～117%之间，RSD (n = 6) 在2.0%～15%之间，其中40 种农药平均回收率在70%～120%之间，符合农药残留分析要求[12]。部分农药的回收率较低，可能与复杂基质的干扰或自身极性、稳定性等理化性质有关。

2.5 实际样品测定结果

根据产地及采集样本数目按比例选择20 批样品，运用所建立的方法测定。结果显示，共有4批次样品检出农药 (表3)。其中，苯线磷和甲胺磷均为农业农村部规定的禁用农药，炔螨特为常见的广谱杀虫杀螨剂。根据《中国药典》2020 年版通则0212 规定[6]：禁用农药不得检出 (低于定量限)，苯线磷与甲胺磷定量限分别为0.02 和0.05 mg/kg。表明样品残留量均未超过标准规定。

表3 实际样品的残留测定结果Table 3 The concentrations of pesticide residues of real samples

3 结论

本研究建立了样品经乙腈高速匀浆提取-HLB固相萃取柱提取与净化，采用高效液相色谱-串联质谱同时测定中药材猴耳环中47 种农药多残留的检测方法。本方法简单高效，重现性好，准确度高，为中药材猴耳环的日常监控、残留限量制定及风险评估等提供了可靠的分析手段。