含嘧啶硫醚的嗜球果伞素类化合物的设计、合成及杀菌活性

郝树林, 蔡增飞, 曹杨羊, 杜晓华

(浙江工业大学 催化加氢中心，浙江省绿色农药清洁生产技术研究重点实验室，浙江省绿色农药协同创新中心，杭州 310014)

杂环化合物是新农药研究的重点之一，其中含氮杂环化合物占现有超高效农药品种的80%左右，嘧啶类尤为突出，如杀菌剂嘧菌酯、氟嘧菌酯、乙嘧酚磺酸酯，杀虫杀螨剂嘧螨醚、嘧螨胺、环虫腈和大部分磺酰脲类除草剂等[1-7]。此外，许多农药分子中含有取代烯烃和炔烃[7-9]，比如：杀虫剂氟噻虫砜，杀菌剂胺苯吡菌酮、双炔酰菌胺、快螨特，除草剂烯草酮、丙炔氟草胺等(图式1)。引入取代烯烃和炔烃，可通过氢键、π-π 效应或者其他方式增强其与生物大分子间的作用，干扰生物大分子的功能。

嗜球果伞素类杀菌剂是以天然抗生素strobilurin A 为先导化合物开发的一类新型杀菌剂[10]。自从1996 年原ICI (捷利康，现先正达) 开发的全球第1 个甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂嘧菌酯上市以来，醚菌酯、肟菌酯和苯氧菌胺等数10 个品种陆续商品化，其中包括原沈阳化工研究院 (现中化沈阳农研公司) 开发的丁香菌酯、烯肟菌酯、唑菌酯等和浙江省化工研究院开发的苯醚菌酯[7,9,11-16](图式2)。

Strobilurin 类杀菌剂的作用机理主要是它们能结合在真菌的细胞色素b 的还原型辅酶Q 的氧化位点，通过阻止三磷酸腺苷 (ATP) 的产生，干扰真菌体内的能量循环，从而抑制整个新陈代谢过程[17-18]。尽管该类杀菌剂作用机理相同，但是不同结构的适用作物和防治对象、以及抗性发生情况还存在很大差别[7]，因此具有活性结构的strobilurin类化合物仍值得继续研究。本研究以嘧菌酯为先导化合物，通过活性亚结构拼接，在分子中引入烯烃基嘧啶硫醚结构片段，设计合成了一系列结构新颖的化合物，并进行了杀菌活性筛选。目标化合物的设计和合成路线分别见图式3 和图式4。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Bruker Avance III 500 MHz 和Bruker 400 MHz核磁共振仪 (CDCl3或者DMSO-d6为溶剂, TMS作为内标)。全部试剂均为市售分析纯化学试剂。柱层析硅胶 (200～300 目) 产自青岛海洋化工厂。97% 噻呋酰胺 (thifluzamide) 和 97% 嘧菌酯(azoxystrobin) 原药由浙江化工研究院测试中心提供; 15% 7b 乳油 (EC) 由本课题组配制；250 g/L 嘧菌酯悬浮剂 (azoxystrobin 250 g/L SC，阿米西达)产自英国先正达有限公司；25% 乙嘧酚悬浮剂(ethirimol 25% SC) 产自深圳诺普信农化股份有限公司。

1.2 化合物合成

1.2.1 中间体6 合成方法 β-甲氧基丙烯酸甲酯活性基团化合物6a ((E)-methyl 2-(2- (chloromethyl)phenyl)-3-methoxyacrylate) 参考文献方法[14-18]合成；肟基乙酸酯化合物6b ((E)-methyl 2-(2-(bromomethyl) phenyl)-2-(methoxyimino) acetate) 参考文献[19]合成；甲氧基氨基甲酸酯类化合物6c(methyl-2-(bromomethyl)phenyl(methoxy)carbamate) 参考文献[20-21]合成。

1.2.2 中间体3 通用合成方法[22-23]将取代β-酮酸酯 (0.10 mol) 和硫脲 (0.12 mol) 加入 100 mL 无水乙醇中，室温下搅拌，滴加30% 的乙醇钠溶液(0.22 mol)，回流反应12 h。在旋转蒸发器上浓缩混合物，将残留物溶解于80 mL 水中，滴加盐酸调节至弱酸性 (pH=3～5)，析出固体。抽滤，用30mL 水洗涤滤饼，收集滤饼并烘干，得到化合物3。

1.2.3 中间体5 通用合成方法[24-28]将化合物3(0.10 mol) 和碳酸钾 (0.12 mol) 加入50 mL DMF中，加热到40 ℃，滴加4-溴-1,1,2-三氟-1-丁烯(4，0.11 mol)，滴加完毕后升温至50～60 ℃反应8 h。冷却至室温，将反应液倒入150 mL 水中，搅拌下滴加盐酸调至中性，析出固体。抽滤，洗涤，收集滤饼并烘干，得到化合物5。

其中5e、5g 和5h 为已知化合物，5a～5d、5f和5i 是新化合物。5a～5i 的结构表征结果见表1。

表1 化合物 5a～5i 的理化数据及 1H NMR 谱图Table 1 Physical properties, 1H NMR of compounds 5a-5i

1.2.4 目标化合物7 通用合成方法[29-30]将化合物5 (10.0 mmol) 和碳酸钾 (12.0 mmol) 加入20 mL DMF 中，室温搅拌0.5 h，分批加入化合物6 (10.5 mmol) 后升温至85 ℃ 继续反应8 h。冷却至室温，将反应液加入到60 mL 水中，用乙酸乙酯 (3 × 30 mL) 萃取，合并有机层，用食盐水(2 × 20 mL)洗涤，无水硫酸镁干燥。过滤，滤液浓缩，粗品经柱层析 (V (乙酸乙酯) : V (石油醚) =1 : 8) 分离，得到目标化合物7a～7v。

1.2.5 化合物15% 7B EC 制备方法 分别将39 g化合物7B、13 g 乳化剂70B、22 g 乳化剂1602、13 g 乳化剂2507 和163 g 溶剂ND-60 加入混合釜中，热水浴中加热搅拌溶解，混合均匀，即可得到15% 7B EC。

1.3 杀菌活性测试

1.3.1 室内抑菌活性 供试靶标为：黄瓜白粉病菌Sphaerotheca fuliginea、黄瓜霜霉病菌Pseudoperoniospora cubensis、黄瓜灰霉病菌Botrytis cinerea 和水稻纹枯病菌Rhizoctonia solani[31]。

准确称取目标化合物7 (精确至0.000 1 g)，用含1%吐温-80 的DMF 溶解，配制成质量分数为1%的母液，用蒸馏水稀释后备用。生物活性普筛和初筛测定均采用盆栽活体试验法。各处理重复3 次 (参照创制农药生物活性评价SOP (杀菌剂卷))。试验供试作物为培养至2 片真叶期的盆栽黄瓜苗 (品种为宝扬5 号)和培养至两叶一心的盆栽水稻苗 (品种为绍粳18) 。采用孢子悬浮液喷雾接种法测定药剂对黄瓜白粉病菌和黄瓜霜霉病菌的杀菌活性；采用盆栽苗接菌丝块法测定药剂对黄瓜灰霉病菌和水稻纹枯病菌的杀菌活性。接种后的作物置于人工气候室中培养，对以上病害分别培养7～8 d 后调查防效。噻呋酰胺作为防治水稻纹枯病菌的对照药剂，嘧菌酯作为防治黄瓜霜霉病菌、黄瓜灰霉病菌和黄瓜白粉病菌的对照药剂，质量浓度均为200 mg/L。

1.3.2 防治黄瓜白粉病田间试验 田间小区试验地点为河北省保定市日光温室，时间为2019 年12 月中下旬，越冬黄瓜 (“津绿2110”，对白粉病感病)。供试药剂为15% 7b EC，处理剂量分别为有效成分 225.00、281.25 和 337.50 g/hm2，以 250 g/L 嘧菌酯SC (处理剂量为有效成分281.25 g/hm2) 和25%乙嘧酚SC (处理剂量为有效成分300.00 g/hm2)为对照药剂。试验地水肥条件较好，栽培管理条件一致。于黄瓜定植后52 d、在白粉病极零星发生时开始茎叶喷施药液，施药液量为900 L/hm2(满架)。试验设12 个处理，每个处理设3 次重复，共36 个小区，小区随机区组排列，每小区1 架两行种植 54 棵，1.3 m × 11 m = 14.3 m2。每个处理3 次重复对应3 个小区，面积为42.9 m2，喷水量 4 L (满架)。

根据《农药田间药效试验准则》[32]中的相关标准，以病情指数计算药剂的防治效果，并用邓肯氏新复极差法进行显著性测定。病害分级[32]：0 级：无病；1 级：病斑面积占整个叶面积小于5%；3 级：病斑面积占整个叶面积的6%～10%；5 级：病斑面积占整个叶面积的11%～20%；7 级：病斑面积占整个叶面积的21%～50%；9 级：病斑面积占整个叶面积的51%以上。按公式(1)～(3)计算病叶率、病情指数及防治效果。

式中：CK0为空白对照区施药前病情指数；PT1位药剂处理区施药后病情指数；CK1为空白对照区施药后病情指数；PT0位药剂处理区施药前病情指数。

2 结果与分析

2.1 目标化合物的合成

以取代β-酮酸酯为起始原料，在碱性条件下与硫脲反应生成嘧啶硫醇；根据硫原子和氧原子亲核能力的差异，与不饱和卤代烯烃发生选择性反应，得到不饱和烯烃嘧啶硫醚中间体5；然后其与甲氧基丙烯酸酯类苄卤中间体6 发生亲核取代反应得到目标化合物7a～7v。其结构表征数据见表 2 和表 3。

在合成中间体5 时，如果反应条件选择不当，就可能存在卤代物接到嘧啶5 位的氧原子上，或者硫和氧原子均可能与卤代物发生反应。根据同族元素中硫和氧原子给电子能力和电负性的差异，通过多个反应条件和反应温度的探索，最终选择以DMF 作为溶剂，碳酸钾为缚酸剂，反应温度控制在50～60 ℃，可以高选择地得到中间体5；如果碱性太强，反应温度高于60 ℃，嘧啶4 位氧原子与卤代物发生的副反应产物则明显增加[33-34]。

2.2 目标化合物图谱剖析

以目标化合物 7a 的1H NMR 和13C NMR 数据为例进行说明。δ 7.63 的单峰为β-甲氧基丙烯酸甲酯活性基团 C＝CH 氢；δ 7.42～7.44、δ 7.30～7.34 和 δ 7.11～7.14 间的多重峰为 3 个苯环氢；δ 6.47 的单峰为嘧啶环上5 位氢；δ 5.23 的单峰为与苯环相连的亚甲基上2 个氢；δ 3.79 的单峰为酯基 COOCH3上 3 个氢；δ 3.58 的单峰为烯醚C＝CHOCH3上甲基的 3 个氢；δ 3.24～3.26 三重峰为三氟丁烯基与硫原子相连的亚甲基上2 个氢；δ 2.69～2.78 间的多重峰为三氟丁烯基上与双键相连的亚甲基上2 个氢；δ 2.31 的单峰嘧啶环6 位甲基上3 个氢。δ 168.84 嘧啶环上2 位碳原子；δ 168.14 嘧啶环上 4 位碳原子；δ 166.83 嘧啶环上6 位碳原子；δ 102.28 嘧啶环上5 位碳原子；δ 168.63 羰基碳原子；δ 160.63 和 108.73 为苯环上相连的烯键碳原子；δ 153.23 与两个氟原子相连的烯烃端位碳原子的多重峰；δ 127.95 与一个氟原子相连的烯烃碳原子的多重峰；δ 135.01, 132.41,131.16, 128.15, 127.73, 127.47 为苯环上碳原子峰；δ 65.68 为苯环相连的亚甲基碳原子峰；δ 61.72 为酯基上甲基碳原子峰；δ 51.12为烯键相连的甲氧基上甲基碳原子峰；δ 26.03 为含硫亚甲基碳的峰；δ 25.49 为三氟丁烯上靠近双键的亚甲基上碳的dd 峰，J = 26.3 Hz, J = 2.5 Hz；δ 23.13 为嘧啶环上相连的甲基碳的峰。

2.3 杀菌活性

室内杀菌活性测定结果显示：在200 mg/L下，所有目标化合物对水稻纹枯病菌、黄瓜灰霉病菌和黄瓜霜霉病菌的抑制率在0～50%之间；化合物7a、7b 和7h 在200 mg/L 下对黄瓜白粉病菌的抑制率为100%，7i～7l 和7r 的抑制率≥80%，7f、7h、7k、7n、7s～7v 的抑制率 50%，7e、7g、7i 和7o～7q 均无抑菌活性。而在相同浓度下，对照药剂噻呋酰胺对水稻纹枯病菌的抑制率为100%，嘧菌酯对黄瓜灰霉病菌、黄瓜霜霉病菌和黄瓜白粉病菌的抑制率分别为86%、95%和100%。以上数据表明，目标化合物对黄瓜白粉病菌具有

一定或较好的杀菌活性。在此基础上，对抑制率达到80% 及以上的化合物又进行了生物活性初筛。结果 (表4) 表明：在100 mg/ L 时，化合物7b和7d 对黄瓜白粉病菌的抑制率分别为100%和82%；在50 mg/L 时7b 的抑制率仍达85%。

表2 目标化合物7a～7v 的理化数据及高分辨质谱Table 2 Physical properties, HRMS of compounds 7a-7v

表3 目标化合物 7a～7v 的 1H NMR 和 13C NMR 数据Table 3 The 1H NMR and 13C NMR data of compounds 7a-7v

续表 3Table 3 (Continued)

2.4 结构活性关系讨论

从初筛数据可以发现，当Q 为β-甲氧基丙烯酸甲酯 (Q1)、R1是甲基或者二氟甲基时，化合物7a～7d 对黄瓜白粉病菌的抑制活性较好，随着官能团变大，抑制率降低或者消失。当Q 为肟基乙酸酯 (Q2) 和甲氧基氨基甲酸酯类 (Q3) 时，同样发现随着R1相对分子质量变大和链变长，其对黄瓜白粉病菌的抑制作用越来越差或者消失。从表4数据可以发现，当Q 为β-甲氧基丙烯酸甲酯 (Q1)、R1= CH3时，R2对黄瓜白粉病菌的抑制率顺序是CH3(7b) ＞ H (7a) ＞ n-Bu (7c)。

2.5 化合物7b 的田间试验结果

对初筛活性较好的化合物7b 进行了田间试验。15% 7b EC 分别按有效成分225.00、281.25和337.50 g/hm2的剂量喷施1 次，第7 天时调查发现：其对日光温室内黄瓜白粉病的防治效果分别为85.4%、88.0%和89.6%，与对照药剂嘧菌酯在有效成分281.25 g/hm2下喷施1 次的防效(89.3%) 及乙嘧酚在有效成分300.00 g/ hm2下喷施1 次的防效 (90.4%) 相当；但15% 7b EC 以有效成分225.00 g/hm2喷施2 次的防效 (85.8%) 显著低于乙嘧酚 (281.50 g/hm2) 喷施2 次的防效 (91.8%)；而15% 7b EC 以有效成分281.25 和337.50 g/hm2喷施2 次的防效 (88.9%、91.8%) 则与乙嘧酚有效成分300.00 g/hm2喷施2 次的防效 (91.8%) 相当(表 5)。

表4 部分化合物对黄瓜白粉病菌的初筛结果Table 4 Preliminary screening results of some compounds for Sphaerotheca fuliginea

表5 化合物7b 对日光温室黄瓜白粉病药效试验结果Table 5 The results of field trials of 7b (15% EC) for Sphaerotheca fuliginea

3 结论

以嘧菌酯为先导化合物，通过活性亚结构拼接等手段引入烯烃硫醚结构，合成了22 个结构新颖的化合物。室内生物活性测试结果显示，多个化合物对黄瓜白粉病菌具有较好的抑制率。田间试验结果表明，化合物7b 在有效成分281.25 g/hm2时对黄瓜白粉病的防效与对照药剂嘧菌酯 (281.25 g/hm2) 和对白粉病有特效[35]的乙嘧酚 (300.00 g/hm2)的防效相当，具有进一步研究的价值。本研究为新型烯烃嘧啶硫醚类化合物的设计与构效关系研究提供了新思路。