磺胺二甲嘧啶在黄河鲤体内的代谢动力学研究

许振山，张伟丽，孙晓彤，王先锋，李 慧，梁俊平

（河南师范大学 水产学院/河南省水产动物养殖工程技术研究中心，河南 新乡 453007）

黄河鲤(Cyprinus carpio)，属鲤形目、鲤科、鲤亚科，是我国黄河流域长期自然形成的特有的重要淡水经济鱼类，是我国宝贵的鱼类资源[1]。五大名鲤之一的黄河鲤是河南省的重要养殖品种，养殖产量约占全省养殖鱼类中的30%[2]。近年来，黄河鲤采取集约化池塘养殖模式，通过高密度放养苗种、大量投饲、投喂高营养饲料等，单位面积产量获得大量提高，然而，随之病害也频繁发生。近年来暴发的鲤鱼烂鳃病，给其养殖业造成了巨大的经济损失。养殖户不得不使用各种药物以减少损失、获得养殖成功[3⁃4]。由于部分养殖户缺乏科学的用药技术，加之许多渔药是从兽药直接转移而来，缺乏科学用药指导，因此在水产养殖生产中存在一定的用药误区，给黄河鲤的健康养殖及其食用带来了潜在风险。

磺胺类药物是黄河鲤养殖生产中常用的化学合成抗菌药，具有抗菌谱广、性质稳定、价格便宜等优点。磺胺二甲嘧啶是磺胺类药物中抗菌作用最强的药物之一，对大多数革兰氏阳性、革兰氏阴性细菌都有抑制作用[5⁃6]。目前，关于磺胺二甲嘧啶的代 谢 动 力 学 研 究，主 要 集 中 在 鸡[7⁃8]、猪[9]、牛[10⁃11]、羊[12]等畜禽，在水产动物中，仅见于大菱鲆(Scophthalmus maximus)[13⁃14]、银 鲫(Carassius auratus gibelio)[15]、鲫(Carassius auratu)[16]和 黑 鮶(Sebastodes fuscescens)[17]中的药物代谢动力学及残留研究，在黄河鲤中的研究还鲜见报道。在水产养殖中使用的磺胺二甲嘧啶主要为兽药中移植而来，缺乏相关的药效学、药理学研究，无法制定出科学合理的给药方案，因而形成恶性循环，容易造成药物过量残留，影响食用安全[18⁃19]。鉴于此，以黄河鲤为研究对象，研究磺胺二甲嘧啶在其体内代谢动力学特征，依据PK/PD 模型，探讨磺胺二甲嘧啶在黄河鲤养殖中最佳给药方案，以减少药物残留，保障消费者食用安全。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物 健康黄河鲤购于郑州中牟某养殖场，体质量（60±5）g，养殖于循坏流水养殖系统，水温（23±2)℃，连续充气，试验前检测无药物残留，每天投喂3 次商品配合饲料，暂养14 d 后开始正式试验。

1.1.2 试验药品及试剂 磺胺二甲嘧啶原粉（含量≥99.0%，美仑公司），磺胺二甲嘧啶标准品（含量≥99.0%，美仑公司），N4-乙酰化磺胺二甲嘧啶标准品（含量≥99.9%，Witega），乙腈（含量≥95.0%，Merck 公司）；冰醋酸（含量≥99.5%），磷酸、三乙胺（含量≥95.0%），正己烷（含量≥95.0%）均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 仪器与设备 高效液相色谱仪（Agilent Technologies 1260 Infinity）；紫 外 检 测 器（Agilent Technologies 1260 Infinity G4225A）；色 谱 柱 为Aglient Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

1.2 给药及取样

给药方法：根据黄河鲤平均体质量，计算给药剂量20 mg/kg 所需要的磺胺二甲嘧啶为0.13 g。准确称取磺胺二甲嘧啶原粉0.13 g，用适量NaOH 助溶，再用0.65%灭菌生理盐水作为溶剂配成质量浓度为13 g/L 的药液。湿毛巾包裹鱼体，用1 mL 无菌注射器吸取0.1 mL 配制好的药溶液进行尾静脉注射或口灌，观察无出血、无回吐的鲤鱼用于试验。

取样方法：分别于给药后的0.25、0.5、1、2、4、6、12、24、48、72 h 等时间点取样，同一时间点取7 尾鱼。用1 mL 无菌注射器尾静脉取血，置于2 mL 的离心管中，在5 000 r/min的转速下离心10 min，离心后取上层血清于新的2 mL 离心管中，放置于-20 ℃保存备用。同时将鱼解剖，取部分肌肉、全部脑组织，剥离出肾脏和肝脏等组织样品，放置于-20 ℃保存备用。

1.3 色谱检测

1.3.1 样品前处理 血清处理：将血清样品于室温条件下解冻后，5 000 r/min离心10 min，取500 μL上清液于离心管中，加入4 mL 乙腈，置旋涡仪中涡旋至沉淀均一无块状，放置片刻，再次涡旋，静置2 h后以5 000 r/min 的转速离心10 min，吸取上清液转移到玻璃试管中，用氮吹仪于37 ℃水浴吹干，加入1 mL 配制好的流动相溶液（乙腈∶磷酸=20∶80）和500 μL 的 正 己 烷，使 用 旋 涡 仪 涡 旋10 s，静 置30 min，弃上层吸取下层溶液，用0.22 μm 微孔有机滤膜过滤后上机测定。

组织处理：待组织样品在室温解冻后，用电子天平准确称量脑、肾脏、肝脏的质量，肌肉称取1 g。将组织剪碎并放于10 mL 的离心管中，加入1 mL 乙腈，用组织匀浆机12 000 r/min 匀浆30 s，分别用2 mL 和1 mL 乙腈清洗刀头2 次，合并3 次提取液，涡旋至沉淀均一无块状，静置2 h后以5 000 r/min的转速离心10 min，吸取上清液转移到玻璃试管中。之后操作步骤与血液处理方法相同。

1.3.2 色谱条件 色谱柱：Agilent Zorbax TC-C18的（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流动相∶乙腈:磷酸（0.01 mol/L，pH 值3.4）=20∶80；紫外检测器，波长267 nm；柱温30 ℃；流速1.0 mL/min，进样量20 μL。

1.3.3 标准曲线绘制 标准溶液的配制：准确称取0.005 g磺胺二甲嘧啶标准品，用5 mL 0.1%的NaOH溶液助溶，然后用流动相定容至50 mL，配成100 mg/L 的母液，再用流动相分别稀释成50.00、25.00、10.00、5.00、1.00、0.50 mg/L 的标准溶液，将其保存于4 ℃的冰箱中备用。N4-乙酰化磺胺二甲嘧啶标准溶液的配制方法与磺胺二甲嘧啶相同。

标准曲线的绘制：分别取500 μL 质量浓度为50.00、25.00、10.00、5.00、1.00、0.50 mg/L 的磺胺二甲嘧啶标准溶液和N4-乙酰化磺胺二甲嘧啶标准溶液加入到500 μL空白血清中，按照前述样品处理方法，最后定容到500 μL。分别取1 mL 质量浓度分别为50.00、25.00、10.00、5.00、1.00、0.50 mg/L的标准品加入到1 g脑、肌肉、肾脏、肝脏4种组织的空白样品中，按照前述样品处理方法，最后定容到1 mL。所得溶液经0.22 μm 有机滤膜过滤后进行高效液相色谱仪测定，将所得结果以峰面积为横坐标、质量浓度为纵坐标做标准曲线，并求出回归方程和相关系数。

1.4 数据分析

1.4.1 药物代谢动力学参数分析 血液中药物代谢动力学参数采用DAS 2.0 药物代谢动力学软件进行分析，用一、二和三室模型分别以权重1、1/C、1/C2进行拟合，根据AIC 和R2值来判断最适合的房室模型，并计算药物代谢动力学参数。

1.4.2 磺胺二甲嘧啶给药剂量计算 根据Css=F×X0/（Vd×K10×τ）计算黄河鲤磺胺二甲嘧啶给药剂量[20]。式中，Css：期望达到的稳态血药浓度；F：生物利用度；X0：每日给药剂量；Vd：表观分布容积；K10：药物在中央室消除速率；τ：给药间隔时间。X0=Css×K10×Vd×τ/F。

2 结果与分析

2.1 药物标准曲线

磺胺二甲嘧啶质量浓度为0.50～50.00 mg/L 时，其在血液、脑、肌肉、肾脏、肝脏中的标准曲线方程：y=0.007 7x+0.115 8（R2=0.999 8）、y=0.009 4x-0.208（R2=0.999 9）、y=0.009 1x-0.008 3（R2=0.999 9）、y=0.008 1x+0.039 1（R2=0.997 7）、y=0.014 8x-0.261 5（R2=0.999 6）。N4-乙酰化磺胺二甲嘧啶质量浓度在0.50～50.00 mg/L 时，其在血液、脑、肌肉、肾脏、肝脏中的标准曲线方程：y=0.009 9x（R2=0.998 6）、y=0.009 8x-0.277 8（R2=0.999 4）、y=0.001 6x-0.074 8（R2=0.999 6）、y=0.010 7x-0.242 9（R2=0.999 4）、y=0.014 8x-0.261 5（R2=0.999 6）。

2.2 磺胺二甲嘧啶及其代谢物在黄河鲤血液中的质量浓度变化

如表1所示，静脉注射磺胺二甲嘧啶后，黄河鲤血液中磺胺二甲嘧啶质量浓度在0.25 h 达到峰值20.69 mg/L，之后逐渐降低，血液中N4-乙酰化磺胺二甲嘧啶质量浓度在24 h 达到峰值2.22 mg/L；对黄河鲤口灌磺胺二甲嘧啶后，血液中磺胺二甲嘧啶质量浓度在1 h 达到最大值17.90 mg/L，N4-乙酰化磺胺二甲嘧啶质量浓度在12 h达到峰值2.22 mg/L。

表1 黄河鲤血液中磺胺二甲嘧啶及其代谢物N4-乙酰化磺胺二甲嘧啶的质量浓度Tab.1 The concentration of sulfamethazine and N4-acetyl sulfamethazine in plasma of Cyprinus carpio mg/L

2.3 磺胺二甲嘧啶在黄河鲤体内房室模型及药物代谢动力学参数

采用DAS 2.0 药物代谢动力学软件对黄河鲤血液中磺胺二甲嘧啶药物代谢动力学参数进行分析。结果显示，静脉注射磺胺二甲嘧啶后符合零级吸收二 室 模 型，表 达 方 程 式：C静脉注射=14.48e-7.463t+0.318e-0.035t；口灌磺胺二甲嘧啶后符合一级吸收二室模型，表达方程式：C口灌=6.627e-0.242t+ 8.678e-0.041t-15.305e-34.885t。磺胺二甲嘧啶在黄河鲤血液中的药物代谢动力学参数如表2所示。由表2可知，静脉注射磺胺二甲嘧啶后血药峰质量浓度为20.00 mg/L，消除半衰期为19.964 h，血药浓度-时间曲线下面积为253.686 h·mg/L，表观分布容积为0.911 L/kg；口灌磺胺二甲嘧啶后血药峰质量浓度为17.90 mg/L，达峰时间为1 h，吸收半衰期为0.02 h，消除半衰期为16.927 h，血药浓度-时间曲线下面积为236.686 h·mg/L，表观分布容积为1.406 L/kg，生物利用度为93.30%。

表2 黄河鲤体内磺胺二甲嘧啶的药物代谢动力学参数Tab.2 Pharmacokinetic parameters of sulfamethazine in Cyprinus carpio

2.4 磺胺二甲嘧啶给药剂量

陈超然等[21]报道，磺胺二甲嘧啶对鳗弧菌、嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌的最小抑菌质量浓度均为0.2 mg/L，李梦梦等[22]报道复方磺胺二甲嘧啶对维氏气单胞菌的最小抑菌质量浓度为62.5 mg/L，为保证磺胺二甲嘧啶有良好的抑菌效果，计算时取其最大值62.5 mg/L，每日给药剂量(X0)为137.88 mg/kg。

2.5 磺胺二甲嘧啶在黄河鲤各组织中分布特点

如图1 所示，以20 mg/kg 剂量口灌黄河鲤磺胺二甲嘧啶后，磺胺二甲嘧啶在肝脏中分布速率最快，在0.25 h 即达到峰值44.09 mg/kg，之后逐渐降低，但在6 h 时出现第2 次峰值14.45 mg/kg；磺胺二甲嘧啶在肾脏中分布趋势与肝脏相似，在0.25 h 即达到峰值13.39 mg/kg，之后逐渐降低，同样也在6 h时出现第2次峰值，为8.13 mg/kg。磺胺二甲嘧啶在肌肉和全脑中的分布特点均呈现先升高后降低的趋势，肌肉中峰值出现在4 h，为8.85 mg/kg，在全脑中峰值出现在1 h，为13.07 mg/kg。

2.6 N4-乙酰基磺胺二甲嘧啶在黄河鲤体内的分布特点

如图2 所示，在肝脏、肾脏、肌肉中均检出磺胺二甲嘧啶代谢产物N4-乙酰基磺胺二甲嘧啶，在肝脏中含量最高，其次为肾脏，在肌肉中含量较低。脑组织中未检测出N4-乙酰基磺胺二甲嘧啶。

肝脏中N4-乙酰基磺胺二甲嘧啶含量在口灌后的12 h 达到峰值，为16.80 mg/kg，之后快速下降，72 h 时降至7.72 mg/kg。肾脏中N4-乙酰基磺胺二甲嘧啶在4 h 时达到峰值10.80 mg/kg，之后呈现波浪式下降趋势，72 h 时降至1.06 mg/kg。肌肉中N4-乙酰基磺胺二甲嘧啶在2 h 时开始检出，在12 h达到峰值1.21 mg/kg，随后逐渐降低，72 h 时降至最低0.30 mg/kg。

3 结论与讨论

3.1 静脉注射磺胺在二甲嘧啶黄河鲤体内药物代谢动力学特征

黄河鲤以20 mg/kg 剂量静脉注射磺胺二甲嘧啶后，表观分布容积为0.911 L/kg。BARONI 等[11]报道磺胺二甲嘧啶在牛体内的表观分布容积为0.317 L/kg，在羚羊体内为0.399 L/kg。BARONI 等[23]研究发现，磺胺二甲嘧啶在1～15周龄小牛体内的表观分布容积为0.281～0.317 L/kg。磺胺二甲嘧啶在黄河鲤体内的消除半衰期为19.964 h，在牛体内的消除半衰期为7.46 h，在羚羊体内为6.17 h，在不同年龄小牛体内为9.46～7.45 h。由此可见，静脉注射磺胺二甲嘧啶在黄河鲤体内分布较快，组织分布广于畜禽类，消除速率慢于畜禽类。

3.2 口服磺胺二甲嘧啶在黄河鲤体内药物代谢动力学特征

孙爱荣等[14]研究发现，大菱鲆口服磺胺二甲嘧啶后，吸收半衰期为3.647 h，达峰时间为8 h；艾晓辉等[15]报道，银鲫口服磺胺二甲嘧啶后的吸收半衰期为0.655 h，达峰时间为24 h；范能全[16]研究发现，鲫鱼口服磺胺二甲嘧啶后的吸收半衰期为0.782 h，达峰时间为8 h；孙玉增等[17]报道，黑鲪口服磺胺二甲嘧啶后的吸收半衰期为1.69 h，达峰时间为8 h。本研究结果显示，黄河鲤口服磺胺二甲嘧啶后血液中的吸收半衰期为0.02 h，达峰时间为1 h。由此可见，口服磺胺二甲嘧啶在黄河鲤体内的吸收速率快于大菱鲆、鲫、黑鲪等鱼类。

血药浓度-时间曲线下面积和生物利用度是评价药物吸收程度的重要指标之一[24]。大菱鲆口服20 mg/kg 磺胺二甲嘧啶后血药浓度-时间曲线下面积和生物利用度分别为385.409 h·mg/L、47.13%[14]；银鲫口服200 mg/kg 磺胺二甲嘧啶后血药浓度-时间曲线下面积为175.2 h·mg/L[15]；鲫口服200 mg/kg磺胺二甲嘧啶后血药浓度-时间曲线下面积为137.82 h·mg/L[16]；黑鲪口服100 mg/kg 磺胺二甲嘧啶后血药浓度-时间曲线下面积为975.70 h·mg/L[17]。本研究结果显示，黄河鲤口服20 mg/kg 磺胺二甲嘧啶后血药浓度-时间曲线下面积为236.686 h·mg/L，生物利用度为93.30%；同时，磺胺二甲嘧啶在黄河鲤体内的消除半衰期为16.927 h，而在大菱鲆体内为8.8 h[13]，黑鲪体内为4.78 h[17]。说明磺胺二甲嘧啶在鲤体内吸收较为充分，且消除较慢，有利于杀灭病原微生物。

3.3 口服磺胺二甲嘧啶在黄河鲤体内组织分布与代谢

黄河鲤口服磺胺二甲嘧啶后，在肝脏分布最快，0.25 h 即达到峰值44.09 mg/kg，在肾脏中分布趋势与肝脏相似，但低于肝脏；在肌肉和脑中分别在6 h 和1 h 达峰值，远低于肝脏。银鲫口服磺胺二甲嘧啶后，在肌肉中的质量浓度高于肝脏[15]；大菱鲆口服磺胺二甲嘧啶后，在肾脏中质量浓度最高，肌肉中质量浓度也高于肝脏中质量浓度[14]。说明磺胺二甲嘧啶在黄河鲤体内经肝脏首过效应较强。磺胺二甲嘧啶代谢产物N4-乙酰化磺胺二甲嘧啶在肝脏、肾脏、肌肉中均有检出，在肝脏中含量最高，其次为肾脏。说明肝脏和肾脏是磺胺二甲嘧啶的主要代谢器官。在血液中也检测到少量N4-乙酰化磺胺，但并未随血液循环进入脑组织。虹鳟(Oncorhynchus mykiss)口服磺胺间甲氧嘧啶和磺胺间二甲氧嘧啶后，在各组织中也检测到了相应的乙酰化代谢产物[25]，并可以通过脱乙酰作用转化为原药而在动物体内造成残留。SAMUELSEN 等[26]用3 种磺胺药物药浴大西洋庸鲽(Hippoglossus hippoglossus)72 h 后，大约90%的磺胺间二甲氧嘧啶和磺胺甲噁唑在组织中以N4-乙酰化代谢物的形式存在。YUAN 等[27]研究发现，对白兔注射磺胺间二甲嘧啶后，62.1%的药物通过乙酰化进行代谢。虽然鱼类与哺乳动物种类不同，但可通过乙酰化代谢磺胺类药物。

对黄河鲤静脉注射磺胺二甲嘧啶后，组织分布速率快，消除速率慢；口灌磺胺二甲嘧啶后，组织分布速率慢，消除速率快，表观分布容积大，生物利用度较高。磺胺二甲嘧啶在黄河鲤体内通过乙酰化可代谢为N4-乙酰化磺胺二甲嘧啶。根据黄河鲤体内血药浓度及体外抑菌浓度，建议按照138 mg/kg剂量投喂磺胺二甲嘧啶。