TGF-β1/Smad通路在养肺保元汤治疗慢性阻塞性肺病合并肺间质纤维化中的作用

吴俣，刘良丽，朱晓龙

贵州中医药大学第一附属医院呼吸内科，贵州 贵阳 550000

慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一种以持续气流受限为特征的疾病，是一种严重的公共卫生问题，世界卫生组织预测2030年，COPD将成为全球第三位的致死原因，COPD给全世界所带来的经济负担将其列为所有单病种排位的第五位[1-2]。肺间质纤维化(pulmonary interstitial fibrosis，PIF)是以肺泡壁为主并包括肺泡周围组织及其相邻支气管结构发生病变的一组疾病群，临床表现为进行性呼吸团难或刺激性干咳[3]。近年来研究发现肺间质和肺泡纤维化是COPD病变向肺组织深处发展的结果，PIF是COPD发展的必然趋势和病理结局[4-5]。COPD合并PIF后，患者会出现更加严重的缺氧和肺部高血压症状，预期的生存年限中位数也会降低至6年[6-7]。因此抑制COPD向合并纤维化发展有着重要的临床意义。转化生长因子-β1(TGF-β1)/Smad通路是调节组织稳态的关键通路，TGF-β1/Smad通路上调会促进成纤维细胞分化和迁移，在肾脏、肝脏和肺纤维化的研究中都发现了TGF-β1/Smad通路异常激活的情况[8-10]。本研究以COPD合并PIF大鼠模型为研究对象，检测清肺保元汤对肺纤维化的抑制作用，探讨清肺保元汤对TGF-β1/Smad通路的调控作用，以此丰富中药治疗COPD合并PIF的理论，为中医中药治疗COPD合并肺纤维化提供有力佐证。

1 材料与方法

1.1 实验材料 SD大鼠，雄性，250～300 g，15只[SCXK(湘)2016-0002，湖南斯莱克景达实验动物有限公司]、DcR3抗体(Abcam，ab8405)、香烟、养肺保元汤(黄芪30 g、党参15 g、生地黄15 g、熟地黄15 g、太子参15 g、麦冬15 g、当归15 g、淮山药15 g、川芎10 g、茯苓15 g、炒白术15 g、甘草3 g等，由贵阳中医学院第一附属医院药剂科提供，用上述组方500 g加水1 000 mL煎煮两遍，合并煎液为100 mL)。

1.2 主要试剂 苏木素染液(AR11800-1，BOSTER)；伊红染色液(AR11800-2，BOSTER)；TUNEL检测试剂盒(C1088，碧云天)；大鼠转化生长因子β1(TGF-β1)试剂盒(MM-0181R1，酶免)；Mouse Monoclonal Anti-GAPDH(TA-08，中杉金桥，1/2 000)；辣根酶标记山羊抗鼠IgG(H+L)(ZB-2305，中杉金桥，1/5 000)；Rabbit Anti-Smad2(ab40855，Abcam，1/2 000)；Rabbit Anti-Smad3(ab40854，Abcam，1/1 000)；Rabbit Anti-Smad7(ab90086，Abcam，1/1 000)；辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(ZB-2301，中杉金桥，1/5 000)。

1.3 实验分组和给药 15只SD雄性大鼠适应性饲养一周后随机分成正常对照组3只、COPD合并PIF模型组4只(模型组)、COPD合并PIF+DcR3抗体4只(DcR3抗体组)、COPD合并PIF+养肺保元汤4只(养肺保元汤组)。除正常对照组外，大鼠按组分别置于自制60 cm×50 cm×40 cm的有机玻璃吸烟箱吸烟，烟量为5支/次，每天一次，每次吸烟时间为1 h，共计42 d，进行COPD合并PIF造模。造模结束后开始给药，为期一个月，DcR3抗体给药组大鼠尾静脉注射DcR3抗体，浓度1 μg/mL，2次/d，每次3 mL；养肺保元汤给药组大鼠每天灌胃养肺保元汤，3次/d，每次3 mL；而模型组大鼠每天灌胃生理盐水，3次/d，每次3 mL。

1.4 HE染色 样本用福尔马林固定完毕后，石蜡包埋，连续4 μm厚度切片。将石蜡切片进行烤片，然后脱蜡，水化。将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色3 min，盐酸乙醇分化液分化15 s，稍水洗，返蓝液返蓝15 s，流水冲洗，伊红染色3 min，流水冲洗，脱水，透明，中性树脂封片，镜检。

1.5 TUNEL染色 将石蜡切片进行烤片，然后脱蜡，水化。将切片移入湿盒，每个样本上滴加50 μg/mL Proteinase K工作液，37℃反应30 min，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次。每个样本上滴加足够量的TUNEL检测液，45℃避光孵育2 h，PBS洗涤3次。封片，镜检。

1.6 ELISA检测 血浆样品直接进行检测。根据大鼠转化生长因子β1(TGF-β1)试剂盒说明书进行加样、加酶、温育、配液、洗涤、显色、终止、测定等操作。用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

1.7 Western blot检测 取组织液氮研磨成粉末，加入裂解液后再次研磨，将组织匀浆吸入一EP管中，冰上裂解30 min后，4℃，10 000 r/min离心10 min，小心吸取上清，即可获得总蛋白。根据BCA试剂盒测定蛋白浓度，蛋白变性，上样，进行十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳1～2 h，后湿法转膜2 h。一抗溶液孵育，4℃过夜；二抗溶液中室温孵育1～2 h。在膜上滴加ECL曝光液，在凝胶成像系统中曝光。用“Quantity One”软件分析各条带灰度值。

1.8 统计学方法 所有计量资料采用均数±标准差表示。使用Student'st检验进行组间比较。当P值＜0.05时为差异具有统计学意义。所有统计分析均使用SPSS19.0完成，统计图使用GraphPad Prism6.01绘制。

2 结果

2.1 各组大鼠的体质量比较 在整个实验过程中大鼠每周称量体质量，结果如图1所示。在第7周时吸烟造模结束，给药治疗开始。从第六周开始，与正常组大鼠质量比较，DcR3抗体组或者养肺保元汤组大鼠质量降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。与模型组相比，虽然DcR3抗体组或者养肺保元汤组大鼠体质量均值低于模型组，但是差异无统计学意义(P＜0.05)。DcR3抗体给药组与养肺保元汤组大鼠体质量比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

图1 各项大鼠的体质量比较

2.2 DcR3抗体和养肺保元汤对大鼠COPD合并PIF造模的治疗效果 大鼠肺组织切片的HE染色和TUNEL细胞凋亡染色见图2和图3。与正常组比较，经过COPD合并PIF造模的大鼠肺泡变小，肺泡间质增厚有炎性细胞浸润，组织中有更多细胞凋亡。DcR3抗体给药组和养肺保元汤给药组大鼠肺泡间质增生程度低于模型组，细胞凋亡水平也低于模型组。说明两个给药组大鼠的肺组织相比于模型组大鼠更加健康。

2.3 DcR3抗体和养肺保元汤对TGF-β1/Smad通路的影响 WB检测结果显示，与正常组比较，模型组大鼠肺组织中Smad2、Smad3和Smad7蛋白质表达均明显上升，差异均有统计学意义(P＜0.05)；与模型组比较，养肺保元汤组以及DcR3抗体组大鼠肺组织中Smad2、Smad3和Smad7蛋白质表达明显下降，差异均有统计学意义(P＜0.05)；而与养肺保元汤组比较，DcR3抗体组Smad3表达较高，Smad7表达量较低，差异均有统计学意义(P＜0.05)，但Smad2表达量比较差异无统计学意义(P＞0.05)。ELISA检测结果显示，其他各组大鼠血液中TGF-β1含量与正常组比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，见图4和图5。

图2 大鼠肺部组织HE染色结果(×100)

图3 大鼠肺部组织TUNEL染色结果，蓝色为细胞核，绿色为凋亡细胞(×200)

图4 大鼠肺组织中Smad2、Smad3和Smad7蛋白质表达水平WB检测结果

图5 大鼠血浆中TGF-β1含量ELISA检测结果

3 讨论

中国疾病预防控制中心2015年12月28日发布《2015中国成人烟草调查报告》称，我国人群吸烟率为27.7%，其中男性吸烟率为52.1%，与5年前的调查相比，没有显著变化；吸烟是COPD的首要诱因[11]。本实验通过让大鼠高强度被动吸烟42 d来进行造模，造模结束后1个月，取大鼠肺组织切片观察可以见到经过造模的大鼠肺部已经出现了肺泡变小，肺泡间质增厚且有炎性细胞浸润的情况，可以认为大鼠已经处于肺间质纤维化的状态了。这也与COPD持续发展会导致并发PIF的理论相符。而且两个给药组大鼠肺间质纤维化水平要低于未受处理组，可以推测在停止吸烟后，即使COPD不再受诱导，PIF也会持续发展，这显示出了对PIF进行治疗的临床意义。

TGF-β1/Smad通路是影响肺间质纤维化的关键通路。TGF-β1/Smad通路上调会促进细胞增殖抑制细胞凋亡，尤其对成纤维细胞的“上皮-间质转移”过程有显著的诱导作用，最终导致相应区域的组织纤维化，特发性肺间质纤维化就是一种典型病症[12-13]。TGF-β1/Smad通路中转化生长因子β1(TGF-β1)是激活通路的细胞因子，而Smad则是一类受TGF-β受体激活的信号蛋白[14]。Smad2和Smad3被激活后会从TGF-β受体转移至细胞核，引发促纤维化基因过表达[15]。Smad7的表达同样受Smad2和Smad3诱导，但是Smad7主要起着抑制TGF-β受体活性的功能，从而达到抑制TGF-β1/Smad通路的效果[16]。Fas信号通路会激活细胞毒性免疫反应诱导细胞凋亡，对TGF-β1/Smad通路有一定的拮抗效果[17-18]。DcR3是一种分泌蛋白，能够结合Fas受体的对应配体Faslg，从而降低Faslg和细胞表面的Fas受体的结合，达到抑制Fas通路的效果[19]。本实验中DcR3抗体组大鼠为接受尾静脉注射DcR3抗体的COPD合并PIF大鼠，通过DcR3抗体结合DcR3，降低DcR3结合Faslg，从而上调Fas通路抑制TGF-β1/Smad通路，达到降低肺部纤维化的目的。而HE染色结果也反映出DcR3抗体组和养肺保元汤组大鼠肺间质纤维化水平较低。

本实验通过进一步研究各组大鼠肺组织中TGF-β1/Smad通路激活水平，来验证DcR3抗体和养肺保元汤对肺部TGF-β1/Smad通路的抑制效果。结果发现正常组、模型组、DcR3抗体组和大鼠血液中TGF-β1含量都没有显著的组间差异，这也许说明肺部组织表达的TGF-β1主要通过旁分泌作用于周围组织，较少进入血液。肺组织中COPD合并PIF造模的大鼠肺组织中Smad2、Smad3和Smad7蛋白质表达明显上升，而DcR3抗体和养肺保元汤能够降低Smad2、Smad3和Smad7蛋白质表达，这说明COPD合并PIF造模会上调肺组织中TGF-β1/Smad通路，而上调的TGF-β1/Smad通路又会促进组织纤维化。这些实验结果证明了DcR3抗体和保肺养元汤能够抑制吸烟诱导COPD并发PIF的肺组织中TGF-β1/Smad通路的活性，有抑制COPD所并发的PIF进一步发展的疗效。

此外，本研究结果表明养肺保元汤和DcR3抗体具有相似性，也许说明养肺保元汤的有效成分有着上调TGF-β1/Smad通路的效果，这一点值得在未来的研究中做进一步探索。