一种新型铱(Ⅲ)配合物探针分子的制备及其依次对铜离子和硫化氢的识别

庞淇丹 王天然 肖 猱

(首都医科大学药学院化学生物学系， 北京 100069)

在必需金属离子中，铜是继铁和锌之后的第三大微量元素。Cu2+在日常生活中广泛应用，使得Cu2+成为常见的金属污染物。Cu2+过载可能导致严重的疾病，如贫血、朊病毒病、阿尔茨海默症、印度儿童肝硬化、肌萎缩性侧索硬化症以及门克斯病和威尔逊病[1-2]。因二价铜离子在人体中的重要作用而更引起人们广泛关注。考虑到Cu2+离子的重要性，开发出在水溶液中用于检测Cu2+离子的探针分子已成为一个重要的研究课题。硫化氢(H2S)是一种无色易燃且具有刺鼻臭鸡蛋味的气体，是仅次于一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)的第三大内源性气体信号分子。H2S可渗入细胞膜从而阻碍细胞正常呼吸。人体长期暴露在充满H2S气体的环境中会导致嗅觉失灵，意识模糊，严重者甚至失去生命体征。体内H2S浓度过高会导致阿尔茨海默病、糖尿病、唐氏综合征、帕金森病和高血压等，这使得H2S成为诊断和治疗以上疾病的潜在目标分子[3-4]。因此，研制一种对硫化氢具有高选择性和高灵敏度的探针分子，并应用于检测生物样品具有现实科研意义。在常见的多种生物成分检测方法中，荧光传感法效果优异。荧光探针具备选择性好、灵敏度高、操作简单等诸多优点[5-7]。部分荧光探针分子可依次检测铜离子及硫化氢分子，这主要是由于硫离子与金属铜离子结合能力较强，硫化氢在溶液体系中可夺取“探针-铜”配合物中的铜离子，生成硫化铜而释放探针分子，实现“OFF-ON-OFF”型荧光响应。

铱(Ⅱ)配合物因其具备光稳定性好、光学寿命长、量子产率高和斯托克斯位移大等优异的光化学及光物理性质，已成为一类重要的荧光探针分子。通过修饰铱配合物配体结构可获得丰富的细胞靶向配合物及生物探针分子，部分结构已被成功运用于生物识别及显像领域中[8-9]。笔者设计并制备了一个被1,4,7,10-四氮杂环十二烷(轮环藤宁, cyc)功能化的新型铱配合物探针分子Ir-cyc。铱配合物作为荧光发色团，氮杂大环化合物cyc为金属铜离子螯合基团，cyc与铜离子结合后致使发色团上的电子部分转移至cyc环，以致发色团荧光被削弱。因铜离子与cyc的结合能力较强，H2S不能从双核金属配合物中夺走铜离子而释放出Ir-cyc，加之硫离子的重原子效应使双核金属配合物由Ir-cyc-Cu变为Ir-cyc-CuS，荧光进一步猝灭以致消失。因此，笔者所设计探针分子可在水性溶液中依次识别Cu2+和H2S，表现出“ON-OFF-OFF”荧光依次猝灭响应而并非传统的“OFF-ON-OFF”型荧光探针。Ir-cyc为一个铜离子探针，与铜离子螯合后的双核铱(Ⅲ)-铜(Ⅱ)配合物荧光探针Ir-cyc-Cu可作为硫化氢分子探针，这个新探针具备应用于环境监测及生物样品分析的潜力。

1 材料与方法

1. 1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

三重四极杆液相色谱质谱联用仪购自美国沃特世公司，SHIMADZU UV-2600型紫外分光光度计购自日本岛津公司，WFH-204B型手提式紫外灯购自上海精科实业有限公司，HITACHI F-2500型荧光分光光度计购自日本日立公司。

1.1.2 试剂

溴乙酰溴、2-苯基吡啶(2-phenylpyridine, ppy)、1,10-菲罗啉-5-氨基(Phen-NH2)、cyc及硫氢化钠(NaHS)等试剂购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。2-乙氧基乙醇及六氟锑酸银(AgSbF6)购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司。三水合氯化铱(IrCl3·3H2O)购自北京华威锐科化工有限公司。甲醇(MeOH)、乙腈(MeCN)、二氯甲烷(CH2Cl2)、三乙胺(Et3N)、四氢呋喃(THF)、碳酸钾(K2CO3)及五水硫酸铜(CuSO4·5H2O)等试剂购自北京伊诺凯科技有限公司。实验过程所用水为去离子水。

1.2 化合物的合成

铱配合物Ir-cyc的制备包括4步：首先是利用亲核取代反应合成溴功能化的配体分子Phen-Br，这一步反应的原料Phen-NH2和溴乙酰溴；随后以ppy和IrCl3·3H2O为原料在2-乙氧基乙醇水溶液中回流制备氯桥式铱二聚体[Ir(ppy)2Cl]2；第三步反应利用前两部制得的[Ir(ppy)2Cl]2和Phen-Br，通过螯合反应制备了溴功能化的铱配合物Ir-Br；最后，利用Ir-Br与轮环藤宁间的亲核取代反应制备了铱配合物探针分子Ir-cyc。

1.2.1 合成溴功能化的菲罗啉配体[2-bromo-N-(1,10-phenanthrolin-5-yl)acetamide hydrobromide, Phen-Br]

Phen-Br的合成路线参照了Belhadj等[10]和Bos等[11]报道的方法并做了适当调整。将1,10-菲罗啉-5-胺(195.2 mg, 1.0 mmol)置于50 mL圆底烧瓶中，向其中入四氢呋喃 (30 mL)和三乙胺 (101.2 mg, 1.0 mmol)，搅拌30 min使其成透明溶液。将混合物置于冰域中冷却至0 °C后，逐滴加入溶于5 mL四氢呋喃的2-溴代乙酰溴(302.9 mg, 1.5 mmol)，反应液逐渐浑浊。在室温下搅拌反应12 h后过滤。用甲醇淋洗滤渣后干燥产物。

1.2.2 制备氯桥二聚体铱前配物{(ppy)2Ir(μ-Cl)2Ir(ppy)2, [Ir(ppy)2Cl]2}

[Ir(ppy)2Cl]2的制备方法参照了Sprouse等[12]报道的方法并做了适当调整。圆底烧瓶中依次加入IrCl3·3H2O (1.06 g, 3.01 mmol)与2.2当量的配体2-苯基吡啶(1.03 g，6.65 mmol)，接着添加15 mL的2-乙氧基乙醇和5 mL的去离子水。将混合反应物加热回流16 h后有沉淀出现，混合物冷却后再向其中加入50 mL的去离子水沉淀产物，将沉淀产物过滤后依次用水和MeOH/H2O (1∶1)洗涤。最后将产物干燥后得终产物[Ir(ppy)2Cl]2。

1.2.3 合成溴功能化的铱配合物{[Ir(ppy)2(Phen-Br)](SbF6), Ir-Br}

溴功能化的铱配合物Ir-Br的制备路线参照了Schmittel等[13]和Lu等[14]报道的方法并做了适当调整。将[Ir(ppy)2Cl]2(107.2 mg, 0.1 mmol), Phen-Br (63.2 mg, 0.2 mmol)和六氟锑酸银AgSbF6(68.7 mg, 0.2 mmol)混合溶解于30 mL甲醇/二氯甲烷(1∶1)溶液中搅拌，体系回流反应12 h后溶液呈棕黄色且变浑浊。冷却反应体系至室温，用滤纸过滤以除去不溶物氯化银。用旋转蒸发仪将滤液蒸干，以少量二氯甲烷溶解粗产物，并以二氯甲烷/丙酮(1∶1)为洗脱剂，用填有硅胶(SiO2)的柱层析分离纯化产物。

1.2.4 合成铱终配物{[Ir(ppy)2(Phen-cyc)](SbF6), Ir-cyc}

轮环藤宁功能化的铱配合物Ir-cyc的制备路线参照了Ye等[15]和Zhang等[16]报道的方法并做了适当调整。向50 mL圆底烧瓶中加入乙腈(20 mL)、Ir-Br (52.6 mg, 0.05 mmol)、轮环藤宁(17.2 mg, 0.1 mmol)和无水碳酸钾(6.9 mg, 0.05 mmol)等试剂，搅拌使反应体系混合均匀并在回流的条件下反应6 h后停止加热。反应液冷却至室温后通过旋转蒸发仪除去有机溶剂，粗产物用柱层析方法纯化，所用洗脱剂为CH3CN-H2O-KNO3饱和水溶液 (100∶15∶1)。收集含有目标产物的馏分，并通过旋转蒸发除去溶剂。将所得固体溶于干燥乙腈中，以填有棉花的玻璃滴管为过滤装置，过滤除去多余硝酸钾固体，旋干乙腈后得到固体Ir-cyc。

1.3 ESI-MS检测

在检测ESI-MS前，所有待测样品均以少量DMSO完全溶解，随后以甲醇或水稀释至适当浓度待测。

2 结果

2.1 铱配合物探针分子的制备

新型铱配合物探针分子的制备详见图1。配体分子Phen-Br、氯桥二聚体铱前配物[Ir(ppy)2Cl]2、溴功能化的铱配合物Ir-Br及铱终配物Ir-cyc被依次制备。

图1 [Ir(ppy)2Cl]2，Phen-Br，Ir-Br和Ir-cyc的合成Fig.1 Synthesis of [Ir(ppy)2Cl]2, Phen-Br, Ir-Br, and Ir-cyc

2.2 基于电喷雾电离质谱ESI-MS法确定配体及配合物结构

实验合成得到248.2 mg Phen-Br黄色固体，产率：78.5%。ESI-MS(m/z): 315.6[Phen-Br+H+]+与其被质子离子化后的理论值C14H11BrN3O+([Phen-Br + H+]+): 316.0相符。Phen-NH2与溴乙酰溴间所发生的亲核反应是制备Phen-Br的有效方法。ESI-MS谱图详见图2。

图2 Phen-Br在正离子模式下的ESI-MS谱图Fig.2 ESI-MS spectrum of Phen-Br in positive mode

实验制备得到1.11 g黄色配合物粉末[Ir(ppy)2Cl]2，产率：69.0%。ESI-MS (m/z): 500.7为[Ir(ppy)2]2+(C22H16IrN22+)的实测值与其理论值501.1接近; 536.8为[Ir(ppy)2Cl2]2+(C44H32Cl2Ir2N42+)的质核比实测数值，其理论值为536.1，以上两个实测信号均与理论值相符，显示高纯度[Ir(ppy)2Cl]2已被成功制备。ESI-MS谱图详见图3。

图3 [Ir(ppy)2Cl]2在正离子模式下的ESI-MS谱图Fig.3 ESI-MS spectrum of [Ir(ppy)2Cl]2 in positive mode

实验制得91.8 mg黄色固体Ir-Br，产率：43.6%。ESI-MS (m/z): 815.8 [Ir-Br]+， 与C36H26BrIrN5O+的理论值816.1基本相符。ESI-MS谱图详见图4。

图4 Ir-Br在正离子模式下的ESI-MS谱图Fig.4 ESI-MS spectrum of Ir-Br in positive mode

实验制得20.1 mg黄色固体Ir-cyc，产率：35.1%。ESI-MS (m/z): 454.1 [Ir-cyc+H+]2+与其捕获一个质子产生的理论值C44H46IrN9O2+[Ir-cyc+H+]2+)454.7接近，Ir-cyc制备成功，ESI-MS谱图详见图5。

图5 Ir-cyc在正离子模式下的ESI-MS谱图Fig.5 ESI-MS spectrum of Ir-cyc in positive mode

Ir-cyc与Cu2+螯合后所生成的Ir-cyc-Cu在正离子模式下的ESI-MS谱图铱配合物Ir-cyc与Cu2+反应后所生成螯合物的ESI-MS信号峰所显示的质量电荷比数值为242.0，这一实验值与[Ir-cyc-Cu + H+]4+的质量电荷比理论数值(C44H46CuIrN9O4+242.6)相吻合，这说明Cu2+已与轮环藤宁螯合，且这一配位化合物在电喷雾室足够稳定不易被碎片化。另一方面，离子化的配合物带4个正电荷，这说明Cu2+与轮环藤宁配位时3个亚氨基(-NH-)未失去H原子，Cu2+与N原子间形成的键为金属配位键而非金属有机键，详见图6。

图6 Ir-cyc与Cu2+螯合后所生成的Ir-cyc-Cu在正离子模式下的ESI-MS谱图Fig.6 ESI-MS spectrum in positive ion mode of Ir-cyc-Cu generated by chelation of Ir-cyc with Cu2+

2.3 铱配合物的光谱性质

Ir-cyc在水溶液中的紫外-可见光吸收和荧光光谱，Ir-cyc在水溶液中被365 nm激发光照射所发光的色度图，向Ir-cyc水溶液中依次加入Cu2+和NaHS后的荧光光谱变化，详见图7、8、9。图7为铱配合物Ir-cyc在含DMSO的水溶液中所显示的紫外-可见光吸收和发光光谱。Ir-cyc在波长为220～350 nm处有强烈的吸收，而在350～440 nm处吸收较弱。高能带很可能是以配体为中心的(LC)π→π*跃迁，低能吸收带主要是由于单线态及三线态金属到配体荷移跃迁(1MLCT和3MLCT)共同作用所产生。常温下，此溶液在波长为365 nm的激发光照射下，呈现出以580 nm 为中心的橙色发光谱线，这是3MLCT的发射态。为直观的表示铱配合物Ir-cyc的荧光特征，基于图7所示荧光谱线，利用软件CIE1931 Chromaticity Coordinate Calculation计算其色度坐标为：x=0.449,y=0.473(图8)。Ir-cyc在色度图中所示的颜色与其在紫外灯下颜色一致(图9)。Ir-cyc在水溶液中所显示的紫外-可见光吸收和发光光谱与类似铱配合物的光谱性质相似。

图7 Ir-cyc在水溶液中的紫外-可见光吸收和荧光光谱(激发光波长为365 nm)Fig.7 UV-vis absorption and fluorescence spectrum (λex=365 nn) of Ir-cyc in aqueous solution

图8 Ir-cyc在水溶液中被365 nm激发光照射所发光的色度图[CIE (1931)]Fig.8 CIE (1931) chromaticity diagram for Ir-cyc in aqueous solution (λex =365 nm)

图9 向Ir-cyc水溶液中依次加入Cu2+和NaHS后得荧光光谱变化Fig.9 Fluorescence spectra of probe Ir-cyc with the incremental addition of Cu2+ and NaHS in aqueous solution

如图9所示，向Ir-cyc中加入过量Cu2+后，荧光强度大幅减弱，但荧光信号并未消失，在波长为580 nm 处仍可见到荧光响应。这一结果说明Ir-cyc可通过荧光猝灭识别为Cu2+，其产物Ir-cyc-Cu带有弱黄色荧光。随后，将NaHS水溶液逐渐加入到Ir-cyc-Cu体系中，荧光逐渐减弱以致消失，并未出现荧光回升现象，这一现象说明体系内所生成的CuS未脱离轮环藤宁环，而是以Ir-cyc-CuS形式存在(图10)。这一发现有利于使双核金属配合物Ir-cyc-Cu作为硫化氢分子探针而继续被深入研究。

图10 铱探针分子Ir-cyc依次识别Cu2+和H2S的反应机制Fig.10 The sensing mechanism of probe Ir-cyc for Cu2+ and H2S

2.4 反应机制

铱探针分子依次识别Cu2+和H2S的反应机制详见图10。cyc为Cu2+的强螯合剂，他们所形成的络合物和进一步捕获溶液中的Cu2+离子，从而形成惰性双金属配合物Ir-cyc-CuS。

3 讨论

环金属铱配合物是由中心铱原子与碳原子或氮原子间的铱-碳金属有机键和铱-氮配位键形成环状配位化合物。经历近四十年的发展，正一价离子型铱配合物的合成方法已逐渐成熟，主要包括以下4种方法：第一，King等[17]在1985年首次以2-苯基吡啶(ppy)为配体与水合三氯化铱反应，报道了Ir(ppy)3的合成方法，但产率较低；第二，Dedeian等[18]在1991年改善了第一种方法，以三(乙酰丙酮根)合铱(Ⅲ)[Ir(acac)3]为原料与ppy反应制备Ir(ppy)3，该方法所制备的产物产率较高，但原料Ir(acac)3价格较高，而且这种方法主要适用于铱的均配物的制备；第三，Colombo等[19]在1994年报道了以氯桥式铱二聚体[Ir(ppy)2Cl]2为原料，其与过量配体分子反应能得到高产率的铱配合物，而且既可以得到铱的均配物也可制得铱的杂配物；第四，1994年Schmid等[20]基于[Ir(ppy)2Cl]2与三氟甲烷磺酸银(AgOTf)在乙腈溶剂中回流反应制备了含乙腈的铱前配物，该配合物可在较温和的条件下与配体分子反应制备新型铱配合物，但该方法所含步骤较多。综合以上方法的优缺点，笔者以第三种经典方法制备了新型铱配合物Ir-cyc。基于亲核取代反应和螯合反应，完整报道了铱配合物探针分子的制备方法。

ESI-MS法具有高灵敏度、高精确度及响应及时等优点，以微量样品注射器将待测样品注入电喷雾室，离子化的样品分子和碎片离子经过一系列分离后进入质量分析系统。电离后的分子大多带有单电荷，有时也带有多电荷，ESI-MS信号为样品组分的质量电荷比(m/z)。因此，即便是测试高纯度化合物，所测得的谱图也可产生多组分信号峰，这有益于研究者从多角度分析所合成产物生成与否。ESI-MS法可实时测试反应液，这种方法可与薄层色谱法综合运用考察原料消耗及产物生成情况，定性分析反应进展。ESI-MS数据及谱图已成为评价新产物的必要资料。氯桥式铱配合物二聚体[Ir(ppy)2Cl]2有两个ESI-MS信号，与理论值相符的数据Ir3+与C元素之间所形成的键为金属有机键，可消耗Ir3+的一个正电荷，而Ir3+与N或Cl间所形成的键为金属配位键，不消耗Ir3+的正电荷。在电离过程中，桥式结构容易从Ir-Cl处断裂，这也说明Ir与C及N的键合力强于与Cl的键合力。溴功能化的铱配合物Ir-Br实测数值与[Ir-Br]+的理论数值基本相同。此结果一方面证实Ir-Br已被成功制备，另一方面说明Ir-Br为+1价态，实际结构与理论结构相符。轮环藤宁修饰的铱配合物Ir-cyc显示的质量电荷比数值，这与其捕获一个质子所产生的理论数据相符，这一结果也证明Ir-cyc已被成功制备。

本文中所合成的化合物(Phen-Br)、单电荷铱配合物及多电荷铱配合物([Ir(ppy)2Cl]2、Ir-Br、Ir-cyc及Ir-cyc)均已通过ESI-MS谱图中的质量电荷比(m/z)证实。在电喷雾电离质谱测试过程中，有机配体分子以单电荷形式出现，铱配合物分子既有以单电荷形式出现也有以双电荷形式出现，而铱-铜双金属配合物Ir-cyc-Cu以四电荷出现。本研究丰富了铱配合物分子种类，为制备多功能化铱配合物分子提供了可参考的路线和数据。

铱探针分子Ir-cyc在水溶液中有明显的紫外-可见光吸收，在365 nm紫外光照射下显黄色，其色度图坐标为(0.449, 0.473)。Ir-cyc在水溶液中可通过荧光猝灭效应依次识别Cu2+和H2S，实现荧光“ON-OFF-OFF”响应，这证实本文设计并制备的铱配合物Ir-cyc可作为铜离子探针，其铜配合物Ir-cyc-Cu可作为硫化氢探针，这两个新分子具备应用于环境监测及生物样品分析的潜力。