液质联用仪分析氨基酸方法的建立及其在枸杞中的应用

陈贵兰，徐坤，周远明，王倩文

(青岛农业大学中心实验室，山东青岛 266109)

氨基酸是构成蛋白质的基本单位，参与生物的新陈代谢和各种生理过程，是生命有机体的重要组成部分，是生命科学的重点研究内容。基于良好的营养功效和防病治病作用，氨基酸成为营养型化妆品、合成药物、表面活性剂等工业产品的化工原料[1-2]，对蛋白质化学、生物化学和整个生命科学研究以及产品开发、质量控制和生产管理等具有重要意义。近年来，氨基酸分析已成为食品、农业、医学等研究工作中最重要的技术之一[3-4]。

在深入研究氨基酸的过程中，建立实用、快速、灵敏的分析方法具有重要的学术意义和实际应用价值。氨基酸自动化分析由Spackman等[5]人在1958年首先提出，采用阳离子交换色谱与柱后茚三酮衍生结合的方法分析蛋白质中的氨基酸。之后，在此基础上衍生的氨基酸分析方法不断涌现，主要是基于色谱方法的检测手段，包括氨基酸分析仪法、高效液相色谱法和毛细管电泳法等[6-7]。由于氨基酸不具有分光检测所需的生色基团，因此上述色谱方法在对氨基酸进行检测时必须进行柱前或柱后衍生。但衍生化操作步骤繁琐，衍生试剂多为有毒药品，且衍生化合物的稳定性难以直观评判，衍生效率无法有效保证。基于上述研究背景，液相色谱串联质谱法成为氨基酸分析领域新兴的研究方法[8-9]，该方法无需衍生步骤、操作简单、节约实验成本，且样品上机测试周期远短于上述色谱方法，为高效快速的氨基酸分析提供了新思路。

枸杞为茄科枸杞属多年生落叶或半落叶灌木，其果实的干制形式“枸杞”有滋补肝肾、益精明目的功效，是一种常用中药[10-11]。随着人民生活水平和保健观念的日益提升，枸杞已成为一种重要的“药食两用”植物资源。相较于传统红枸杞，黑枸杞富含天然抗氧化剂原花青素和花青素，具有延缓衰老的作用，因而成为养生人士的“新宠”，深受消费者喜爱。基于此，不同种类枸杞的营养学分析成为近年来研究热点之一。本研究基于液相色谱串联三重四极杆质谱方法，建立了氨基酸含量的分析方法，并用该方法测定了不同枸杞中的氨基酸含量，为枸杞的合理开发和利用提供科学依据，具有重要的理论和现实意义。

1 试验材料和方法

1.1 仪器、试剂与试验材料

超高效液相色谱串联三重四级杆质谱仪(1290/6460，美国Agilent公司)，氨基酸分析仪(L8900，日本日立公司)，电子天平(BT125D，德国Sartorius集团)，高速粉碎机(FW100，天津泰斯特仪器有限公司)，真空泵(2xz-2，上海德英真空照明设备有限公司)，超声波清洗器(Elmasonic P，德国Elma公司)，去离子水发生器(Milli-Q，美国Millipore公司)，干燥箱(BA0-80A，施都凯仪器设备有限公司)。

17种氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸、结氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天门冬氨酸、赖氨酸、谷氨酸、蛋氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、络氨酸、组氨酸)标准品、MCI缓冲液套装购于日本日立，甲酸(质谱纯，美国Fisher公司)、乙腈(色谱纯，德国Merck公司)、盐酸、茚三酮(分析纯，国药集团)。

试验所用黑枸杞果实采自青海的野生植株；红枸杞果实为购于市场的人工栽培品种，原产地为宁夏。

1.2 样品前处理方法

枸杞样品低温烘干至恒重，粉碎后过80目筛备用。称取一定量的枸杞样品于20 mL水解管中，加入16 mL 6 mol/L的盐酸溶液，真空脱气30 s后充氮气封管。样品在110 ℃下水解24 h，待冷却后用去离子水无损转移至100 mL容量瓶定容。准确量取1 mL水解液于小瓶中减压抽干脱酸，之后加1 mL去离子水复溶后再次抽干，并重复操作1次。样品上机前充分溶解于1 mL 1%甲酸溶液，经0.22 μm的水相滤膜过滤备用。试验中对样品称样量和减压抽干脱酸温度进行了优化。

1.3 氨基酸含量测定方法

分别采用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱仪和氨基酸分析仪测定样品中氨基酸的含量。

采用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱仪时，色谱条件为：色谱柱为Waters HILIC柱(3 μm，2.1×100 mm)，流动相为0.1%甲酸水溶液(A)和甲醇(B)，流速为400 μL/min，梯度洗脱条件为0～10 min A相从5%梯度升至95%并保持4 min至14 min，柱温30 ℃，进样量为2 μL。另外，为防止不同样品之间的交叉污染，进样针每次取样之后都用新鲜的甲醇溶液冲洗1次。质谱条件为：ESI电喷雾离子源，扫描方式为多反应监测模式，干燥气流速8 L/min，干燥器温度350 ℃，鞘气流速10 L/min，鞘气温度350 ℃，锥孔电压25 psi，毛细管电压3 500 V。试验中，以较优的分离度为目标，对流动相洗脱梯度、离子扫描模式、碎裂电压、碰撞池能量等进行了优化。

氨基酸分析仪分析方法参考国标GB/T 5009.124—2003。比较了两种方法测定结果的差异，相对误差计算公式如下式所示：

式中，RE为相对误差，Xa为本方法测得样品中氨基酸含量，Xb为氨基酸分析仪方法测得样品中氨基酸含量。

1.4 数据分析

液质联用方法测试数据由仪器自带的Mass Hunter定性和定量软件进行数据分析。氨基酸分析仪测试数据由仪器自带的EZChrom Elite软件进行数据分析。

2 结果与讨论

2.1 试验条件优化

首先考察了称样量对氨基酸测试结果的影响，每组称样量重复10次。结果如图1所示，当称样量小于0.1 g时，随着称样量增加，氨基酸含量测定结果的相对标准偏差逐渐减小，这可能是由于称样量过小时样本的代表性太低，导致测试结果误差较大。当称样量大于0.1 g以后，氨基酸含量的测试结果趋于稳定，相对标准偏差变化不大，基本维持在±2%。然而，在称样量大于0.1 g后，氨基酸含量检测结果有所降低。这可能是由于称样量过大时样品水解不完全，导致检测结果偏低。在试验过程中，称样量大于0.1 g后，确实存在水解样品溶液混浊的现象，证明了检测结果偏低由样品水解不完全导致。综合比较之后确定0.1 g为枸杞样品氨基酸测试的最佳称样量。

优化了减压抽干脱酸步骤中干燥箱的温度。试验发现干燥箱温度高于48 ℃时，真空泵的压力设置不易控制，样品爆沸现象明显，且温度过高会导致氨基酸变性，从而造成目标物质的损失。同时，样品抽干速度受温度影响，随着温度降低，抽干速度明显变慢，导致试验周期大大延长。综合比较之后，选择45 ℃下减压抽干，可以保证目标物质回收率和合适的试验周期。

传统氨基酸分析方法中，用低浓度的盐酸或柠檬酸钠缓冲液等对上机前的样品进行复溶[12]。采用液质联用方法进行氨基酸含量的分析时，这些物质会影响目标物质在源区的离子化效率，因此不宜出现在检测系统中。尝试用具有挥发性的甲酸进行样品复溶，得到了良好的回收率，因此上机检测前用1 mL 1%甲酸溶液对样品进行复溶。

优化了液相色谱条件，采用甲醇-甲酸水溶液流动相体系进行梯度洗脱，对17种氨基酸获得了理想的分离效果(图2)，尤其是实现了同分异构体亮氨酸和异亮氨酸的色谱分离，为后续相同核质比下的质谱分析提供了可能。优化条件下，在14 min内完成了17种氨基酸的分析检测，相较于传统氨基酸分析仪分析方法50 min的检测周期大大缩短，极大提高了分析效率。

试验还优化了质谱分析条件。分别研究了17种氨基酸在正、负离子扫描模式下的质谱行为。氨基酸分子中既有易接受质子的-NH2结构，又有易失去质子的-COOH结构，因此理论上正负离子模式下都可以进行质谱分析。试验结果显示，17种氨基酸在正离子模式下质谱信号更强，因此方法采用正离子扫描模式。此外，还通过调整干燥气流量和温度、碎裂电压、碰撞池能量等参数，选择丰度最高、稳定性最好的碎片离子用于后续定量分析。优化后的各氨基酸质谱检测参数见表1。经过对比和优化，得到最优条件下17种氨基酸的质谱信息，见图3。

2.2 方法性能参数

将17种氨基酸标准溶液逐级稀释，得到不同浓度的系列标准工作液，以氨基酸峰面积对浓度进行线性回归，得到各氨基酸的标准工作曲线。17种氨基酸浓度和质谱响应强度呈良好的线性关系，相关系数在0.998 2～0.999 9之间，绝大多数大于0.999。按3倍信噪比(S/N)计算方法的检出限，结果显示，该方法对17种氨基酸均有极高的灵敏度，检出限从0.001 ～0.013 μg/mL不等，明显的优于传统氨基酸分析仪测试方法[13]。用加标试验方法进行回收率试验，经过6次平行试验计算平均回收率和精密度。17种氨基酸回收率在90.7%～102.5%之间，相对标准偏差在0.4%～5.3%之间。方法性能参数详见表2。

表1 氨基酸的质谱检测参数

表2 方法性能参数

2.3 液质联用方法在测定枸杞中氨基酸含量的应用

为验证本方法的可靠性，在优化条件下，分别选择3种不同黑果枸杞和3种不同红果枸杞进行17种氨基酸含量的分析，每种样品进行5组平行试验。测试结果与氨基酸分析仪方法测定结果进行比较，结果详见表3。两种方法的测试结果具有较好的一致性，17种氨基酸单一组分和总氨基酸含量测试结果的相对误差均在10%内，说明本方法在氨基酸分析方面稳定可靠。

3组黑果枸杞中，17种氨基酸总量为10.09%～10.31%，其中含量较高的为天门冬氨酸、谷氨酸和精氨酸。3种黑果枸杞中17种氨基酸含量总体一致，平均含量排序由高至低分别为：天门冬氨酸>谷氨酸>精氨酸>丙氨酸>亮氨酸>丝氨酸>苯丙氨酸>苏氨酸>甘氨酸>缬氨酸>赖氨酸>异亮氨酸>络氨酸>脯氨酸>组氨酸>胱氨酸>蛋氨酸。相应地，3组红果枸杞中，17种氨基酸总量9.26%～9.52%，略低于黑果枸杞，其中含量较高的为天门冬氨酸、谷氨酸和脯氨酸。17种氨基酸含量在红果枸杞中也总体一致，平均含量排序由高至低分别为：天门冬氨酸>谷氨酸>脯氨酸>精氨酸>丙氨酸>丝氨酸>亮氨酸>苏氨酸>缬氨酸>赖氨酸=甘氨酸>苯丙氨酸>异亮氨酸>组氨酸=络氨酸>胱氨酸>蛋氨酸。

杨春霞等[14]以10个枸杞品种为样本，研究了黑果枸杞与红果枸杞氨基酸含量的差异，研究发现黑果枸杞中17种氨基酸总量为11.42%～12.10%，以天门冬氨酸、谷氨酸和精氨酸含量最高；红果枸杞中氨基酸总量为7.416%～8.744%，以天门冬氨酸、谷氨酸和脯氨酸含量最高。对比发现，就单一氨基酸含量排序而言，本文测定结果与其一致，但含量存在一定差异，这种差异可能是由枸杞品种、采摘时间、气候条件和果实成熟度等因素造成的。

由表3可以看出，黑果中丙氨酸、苯丙氨酸和甘氨酸略高于红果，红果仅有脯氨酸含量较黑果略有优势。综合比较，单就营养成分中氨基酸指标来说，黑果枸杞略优于红果枸杞，但优势并不显著。

3 结论

建立了液相色谱质谱联用测定枸杞中氨基酸的方法，该方法测试结果准确可靠、灵敏度高，操作步骤简单、无需衍生化处理，方法快速高效，通用性良好。将该方法用于枸杞中氨基酸含量的测试，测试结果与氨基酸分析仪方法进行比较，令人满意。黑果枸杞和红果枸杞中氨基酸含量无显著性差异，为消费者理性购买提供了科学依据。