VpSBP3基因负向调控转基因拟南芥盐胁迫抗性

陈果，曲衍杰，任桓质，于柏，张玉刚，祝军，侯鸿敏

(1.青岛农业大学园艺学院/青岛市园艺植物遗传改良与育种重点实验室，山东青岛 266109；2.莱阳市照旺庄镇农业技术推广站，山东烟台 265200)

葡萄(Vitisvinifera)是我国最重要的经济果树之一，具有很高的经济价值。在自然条件下，植物体无法随意的移动，其生存环境是相对固定的，因此，高盐条件成为了干扰植物正常生长发育的主要因素之一[1]。现如今，土地盐碱化的不断加重，严重影响葡萄的产量和以葡萄为原料的加工产业的发展。据研究表明，全球盐碱地总面积已超过9.5亿hm2，其中我国的盐碱地面积总计约为9 900万hm2[2]。所以，植物体为了维持自身在逆境条件下的正常生长与发育，通过建立不同的胁迫响应机制来抵抗各种逆境条件[3]。近年来，已有相关研究表明，当植物体受到不同的逆境胁迫时，转录因子可以调控相关基因的表达，在抗逆应答反应中发挥作用[4]。

Squamosa启动子结合蛋白(Squamosa promoter Binding Protein, SBP)最初是从金鱼草(Antirrhinummajus)中分离出来的一类转录因子。因为SBP基因都拥有一个SBP保守结构域，所以被认为是转录因子[5]。SBP保守结构域是一个高度保守的DNA结合域[6-7]，大约由79个氨基酸残基组成，包括两个相互作用且缺一不可的锌指结构，N端为Cys-Cys-His-Cys，C端为Cys-Cys-Cys-His或Cys-Cys-Cys-Cys[8],并且能与顺式作用元件TNCGTACAA结合，其核心序列为GTAC[9]。该基因已陆续从拟南芥[10]、白桦树[11]、衣藻[12]、苔藓[13]、番茄[14]、水稻[15]中分离出来。前期大量的研究表明SBP基因在调控植物开花时间[16-19]、叶片发育[20-22]、植物激素信号转导[23-24]、果实着色和成熟[25-26]等诸多方面起着重要作用。

近年来，也有一些关于该转录因子在植物非生物胁迫[27-29]方面的功能逐渐被关注。2014年，Cui等[30]发现，SPL9基因被miR156下调后，参与了拟南芥响应盐和干旱胁迫的反应；2015年Tan等[31]发现SBP基因在白菜中可以响应各种激素处理及非生物胁迫；类似的，2016年Song等[32]的研究也证明了该基因在菊花中同样具有响应激素处理及非生物胁迫的功能；2017年Arshad等[33]发现MicroRNA156通过降低SBP基因的表达量改善了转基因苜蓿干旱、盐胁迫耐性；2018年Hou等[34]通过拟南芥的异源表达证明了某些葡萄SPL基因的耐盐功能；2019年Wang等[35]通过整合miRNA-Seq和RNA-Seq数据研究了miR156/SPL模块在耐盐性中的作用；2020年Zhang等[27]的研究发现CaSBP12基因的过表达提高了辣椒对盐胁迫的敏感性。本研究通过农杆菌介导法将葡萄VpSBP3转录因子在拟南芥中异源表达，获得转基因拟南芥株系，并通过非生物胁迫及生理指标的测定初步明晰VpSBP3转录因子在葡萄抗逆性方面的功能。该研究在扩大葡萄栽培面积、增加葡萄产量、提高葡萄品质方面有着一定的意义，为以后SBP家族基因在葡萄抗逆性方面的研究奠定了前期理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试材选用‘白河35-1’(Vitispseudoreticulata‘Baihe-35-1’)葡萄株系, 拟南芥(Arabidopsisthaliana)哥伦比亚CO、克隆载体pGEM-T、pCAMBIA2300质粒为本实验室保存。

1.2 试验方法

1.2.1VpSBP3基因的克隆

本试验参照原平皓植物RNA快速提取试剂盒说明书，采用液氮研磨法提取‘白河35-1’叶片RNA，用DNaseⅠ处理总RNA，参照TaKaRa反转录试剂盒说明书进行cDNA的合成，具体试验步骤参照沙婷[36]的实验方法。根据欧洲葡萄SBP基因的同源序列设计特异引物，设计带有XbaⅠ和KpnⅠ酶切位点的引物，上游引物为F：5′-GGCTCTAGAATGGGCTATAATCTGAAGAC-3′XbaⅠ，下游引物为R：5′-GGTACCCTACTCCCAAGAGAACGAGA-3′KpnⅠ。以‘白河35-1’叶片cDNA为模板扩增获得VpSBP3目的片段，送TaKaRa公司测序。

1.2.2VpSBP3基因组DNA序列的扩增

本试验参照林延翔[37]的实验步骤，利用天根公司的DNA提取试剂盒，通过液氮研磨法提取‘白河35-1’叶片总DNA。然后，参照侯鸿敏[38]的扩增反应体系，以‘白河35-1’叶片总DNA为模板进行PCR扩增。

1.2.3 转基因拟南芥株系的获得

利用双酶切法将VpSBP3基因连接到载体pCAMBIA2300-35，测序后将阳性质粒命名为pCAMBIA2300-35S-VpSBP3。将其和pCAMBIA2300-35S空载体通过农杆菌介导的花絮浸润法转化拟南芥，获得T0代种子。在含40 mg·L-1卡那霉素的MS固体培养基上对T0代种子进行筛选，正常生长的苗子确定为转化阳性苗。

将对照和转基因拟南芥种子置于4 ℃冰箱中春化3～4 d后，在超净工作台上进行消毒处理，然后用移液枪点播在MS+150 mmol·L-1氯化钠(NaCl)培养基中，置于光照培养箱中光照培养16 h、黑暗培养8 h。最终选取在培养基中与对照表型有差异的转基因株系作为试验材料。

1.2.4 盐胁迫处理下转基因株系萌发率及根长测定

将T3代转基因株系、空载体pCAMBIA2300对照和野生对照的种子置于4 ℃冰箱中春化3～4 d后，在超净工作台上进行消毒处理，然后分别用移液枪点播在MS和MS+150 mmol·L-1NaCl的培养基上，置于光照培养箱中光照培养16 h、黑暗培养8 h。每2 d观察并统计一次对照与转基因株系的萌发率，直到萌发率趋于稳定。同时把MS和MS+150 mmol·L-1NaCl培养基竖放在培养皿架上，生长15 d后，观察并记录根长。该试验分别进行3次生物学和3次技术重复。

1.2.5 失水率及电解质渗漏测定

用150 mmol·L-1NaCl分别对正常生长的野生型和转基因拟南芥株系进行胁迫处理。7 d后分别取0.1 g表型一致的对照和转基因株系叶片进行电导率的测定。 首先将所取样品分别置入含有50 mL蒸馏水的试管中，静置3～5 h后，用电导仪测其电导值R1，测定结束后将该样品继续放入90 ℃水浴锅中30 min，冷却到室温，测其电导值R2，利用公式R1/R2分别计算其相对电导值[39]。该试验分别进行3次生物学重复和3次技术重复。

1.2.6 丙二醛含量的测定

用200 mmol·L-1NaCl处理转基因和对照株系的盆栽苗，一周后取0.2 g叶片，参照 Dhindsa等[40]的实验方法，利用分光光度计测定丙二醛的含量。该试验分别进行3次生物学重复和3次技术重复。

2 结果与分析

2.1 VpSBP3基因的克隆及序列分析

以‘白河35-1’叶片DNA和总RNA反转录合成的cDNA第一链为模板，用VpSBP3的特异引物扩增，分别获得约1 200 bp 和3 200 bp大小的条带(图1)。将VpSBP3基因连接到pGEM-T载体上，转化大肠杆菌并进行测序，在http://www.ncbi.nlm.nih. gov/ Structure/cdd/wrpsb.cgi上进行cDNA序列分析。分析表明，VpSBP3基因含有一个大小为1 170 bp的开放阅读框，编码一个含有390个氨基酸残基的蛋白质。通过InterProScan蛋白数据库来鉴定该基因的结构域，结果表明VpSBP3基因含有一段高度保守的双向核定位序列和一个完整的SBP-domain结构域(PF03110)(图2)。DNA序列分析发现VpSBP3基因的DNA序列长度为3 200 bp，其中3个外显子长度分别为408、138、624 bp；2个内含子长度分别为1 884、146 bp，其排列的相对位置见图2。

2.2 转基因拟南芥株系的获得

通过花絮浸润法，将含有pCAMBIA2300-35S-VpSBP3质粒的农杆菌转化野生型拟南芥，获得T0代种子。将消毒后的T0代种子铺在含40 mg·L-1卡那霉素的MS培养基上进行转基因阳性苗的筛选。结果表明非转基因拟南芥植株在选择培养基上逐渐白化死亡，而转基因植株可以正常生长(图3A)。将野生对照WT和不同转基因株系拟南芥T3代种子用移液枪点播在提前配制并灭菌MS+150 mmol·L-1NaCl培养基上，春化后在光照培养箱中继续正常培养5 d。结果发现，所有的转基因株系均对盐胁迫敏感。最终选取在培养基中与对照表型差异最明显的转基因株系VpSBP3-26和VpSBP3-42作为后续研究材料 (图3B)。

2.3 VpSBP3转基因拟南芥在盐胁迫培养基上的萌发情况

将野生对照、空载pCAMBIA2300对照和转基因株系同时播种在MS、MS+150 mmol·L-1NaCl培养基上，每隔2 d统计一次发芽率并拍照观察，用prism 8.0软件进行统计分析作图。发现在MS培养基上野生对照、空载pCAMBIA2300对照和转基因株系在2 d时开始萌发，8 d后的萌发率均达到100%(图4A)。而在MS+150 mmol·L-1NaCl培养基上，只有野生对照和空载pCAMBIA2300对照8 d时萌芽率达到100%，而转基因株系12 d时萌发率才达到最高值80%， 可以明显看到MS+150mmol·L-1NaCl培养基上，野生对照和空载pCAMBIA2300对照的萌发率高于转基因株系(图4B)。从图5可以看出，MS培养基上的转基因株系和两个对照的生长情况基本一致，长势良好(图5A)，而胁迫培养基上的两个对照要比转基因株系生长的好(图5B)。以上结果说明转基因株系对盐胁迫环境更加敏感，VpSBP3转录因子在响应过程中具有负向调控作用。

2.4 VpSBP3转基因拟南芥在盐胁迫培养基上的根长情况

将2个转基因株系和2个对照分别种植于培养皿中，并竖放在培养皿架上。本研究用prism 8.0软件进行统计分析作图。观察发现，MS培养基上的转基因株系和对照株系的根长基本一致(图6A,6C)，150 mmol·L-1NaCl胁迫处理20 d后转基因株系和对照株系的根部生长均受到了抑制，但是转基因株系的根长显著低于对照株系(图6B,6C)。结果表明，VpSBP3基因降低了转基因拟南芥的耐盐性。

2.5 模拟盐胁迫处理下VpSBP3转基因拟南芥的失水率及相对电解质渗透率

取150 mmol·L-1NaCl处理和正常培养20 d后的转基因及野生型拟南芥株系进行电解质渗漏处理，分别计算相对电导率。本研究用prism 8.0软件进行统计分析作图。从图7看出，WT、pCAMBIA2300、VpSBP3-

26、VpSBP3-

42在MS培养基上的相对电解质渗透率分别为27.81%、37.60%、36.05%、39.50%，在MS+150 mmol·L-1NaCl培养基上的相对电解质渗透率分别为34.05%、41.23%、66.41%、86.61%。以上结果表明转基因株系相对电解质渗透率比野生对照的低，转基因株系对盐胁迫更敏感，该基因具有负向调控作用。

2.6 盐胁迫处理下VpSBP3转基因拟南芥丙二醛含量的测定

用200 mmol·L-1NaCl处理生长健壮的野生型和转基因株系的拟南芥，每个营养钵浇50 mL，每隔2 d处理一次，处理7 d后，摘取叶片测其MDA含量。本研究用prism 8.0软件进行统计分析作图。从图8中可以看出，在正常条件下培养的野生型和转基因株系的MDA含量基本一致，但在150 mmol·L-1NaCl胁迫处理下，2个转基因株系的MDA含量均显著高于2个对照株系，表明转VpSBP3基因的拟南芥抗逆性显著低于野生型。

3 讨论

随着全球环境条件的不断恶化，导致土地干旱和土地盐碱化越来越严重，使得环境胁迫成为影响植物生长发育的重要因素之一。为了防止这种胁迫的潜在有害影响，植物进化出复杂的网络机制来识别外部信号，并通过不同的细胞信号转导途径进行传导，导致植物体内产生一系列的胁迫响应转录级联反应，影响了相关基因表达。而基因的表达受植物体内各种转录因子的调控，转录因子在植物生命活动中起着关键的调节作用，与DNA结合域共价结合，从而达到抑制或增强基因表达的作用，常见的参与植物抗逆调控过程有WRKY[41]、MYB[42]、bZip[43]等转录因子。

SBP-box基因是一类新的编码DNA结合蛋白的转录因子，他们只存在于绿色植物中。研究表明，这些基因均含有一个SBP保守结构域，其中含有一个C端的双向核定位信号和两个结合DNA的锌指结构。本研究中，对VpSBP3序列分析，发现该基因符合SBP基因的所有结构特征，属于SBP家族成员(图2)。相关研究表明SBP转录因子作为miRNA156的靶基因，参与了植物对非生物胁迫响应过程[44]，但不同的SBP基因在非生物胁迫响应中表现出了不同甚至相反的功能。在拟南芥中，过表达AtSPL1和AtSPL12能够提高其耐热性[45]；干旱、低温和盐胁迫等非生物胁迫可以诱导苹果MdSBP20基因的表达[46]；短期盐胁迫处理下，MdSPL13的过量表达可以提高苹果的耐盐性[47]。与以上研究结果相悖，也有研究表明SBP基因在植物非生物胁迫响应中具有负向调控功能。在拟南芥中miR156可通过下调靶基因AtSPL9提高转基因株系抗盐和抗旱能力[48]；辣椒中CaSBP12基因也可负向调控植株对盐胁迫的耐受性[27]；本研究将VpSBP3基因在拟南芥中过量表达后发现相较于两个对照，盐胁迫处理下转基因株系的种子萌发率更低、根长更短、相对电导率更高和MDA的含量更高。根据以上试验结果可以推测VpSBP3基因的过量表达可能增强了植株对盐胁迫的敏感性。该研究为进一步解析miR156/SBP在植物逆境胁迫中的作用机理提供了一定的理论基础，对植物的抗逆性研究和应用有一定的指导意义。