丙泊酚对人神经胶质母细胞瘤（U343）活性、凋亡、侵袭和转移能力的影响

王昆锋，陈 功，丁 洁

（深圳大学第五附属医院/深圳宝安中心医院麻醉科，广东 深圳 518000）

原发颅内肿瘤的发病率为7.8/10 万人～12.5/10万人，可发生于任何年龄，以20～50 岁多见，神经胶质母细胞瘤是成人最常见原发性中枢神经系统恶性肿瘤，其来源于神经上皮，约占全部颅内肿瘤的40%～50%。临床上主要采用手术方式治疗神经胶质母细胞瘤，但是肿瘤呈浸润性生长，具有较强的转移和侵袭能力，与正常脑组织间边界难于区分，难以作到完全切除干净，一般以术后配合化学治疗、放射治疗等综合治疗，患者预后较差，目前患者的存活期中位数只有1～1.5 年，严重威胁人类的健康[1]。因此，寻找新的药物和方法抑制神经胶质母细胞瘤的增殖和侵袭转移一直是国内外研究的热点和难点。丙泊酚是临床常用的静脉麻醉药，具有作用时间短，作用平稳等特点。研究表明[2,3]，丙泊酚有较好的抑制多种肿瘤细胞（胃癌、肝癌和胰腺癌等）生长和转移。另有研究表明[4，5]，丙泊酚对人神经胶质细胞瘤侵袭和迁移能力具有明显的抑制作用。基于此，本研究主要探究不同浓度的丙泊酚对人神经胶质母细胞瘤（U343）活性、凋亡、侵袭和转移能力的影响及其可能的作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂 超净工作台（Thermo），常规氧气及二氧化碳培养箱（Thermo），CCK-8 细胞活性分析仪，低温高速离心机（Eppendorf），流式细胞分析仪（Beckman Coulter）,Western blot 显影仪器（紫外白光切胶）。丙泊酚注射液（得普利麻），DMEM/F12 培养基和胎牛血清（Gibco）。一抗：兔抗GAPD 多克隆IgG 抗体（杭州贤至生物科技有限公司）二抗：HRP偶联山羊抗兔IgG 二抗。

1.2 人神经胶质母细胞瘤（U343）的培养 将新配制的含10%胎牛血清的Gibco 培养液加入到人神经胶质母细胞瘤中（购于中国科学院细胞库）。细胞常规置于37 ℃、5% CO2常氧培养箱中培养。细胞贴壁达80%以上进行传代，将传代后处于对数生长期的人神经胶质母细胞瘤（U343）用于实验。

1.3 细胞模型的建立 随机将处于对数生长期的细胞分为4 组，分别为N 组，S2 组（Propofol 2 μmol/L），S5组（Propofol 5 μmol/L），S10 组（Propofol 10 μmol/L）。四组实验细胞均加入含10%胎牛血清的Gibco 培养液，除N 组外，其余3 组加入相应剂量的丙泊酚。

1.4 CCK-8 法检测细胞活力 将人神经胶质母细胞瘤（U343）按1×105个细胞/100 μl 的密度将其接种于96 孔板中。细胞接种完成后，放置在37℃、5%CO2常氧培养箱中培养。待细胞贴壁生长后，从培养箱中弃去旧的培养基，PBS 清洗2 次后建模，再次分为4 组，分别为N 组，S2 组（Propofol 2 μmol/L），S5组（Propofol 5 μmol/L），S10 组（Propofol 10 μmol/L），每组分6 个复孔。放入常规培养箱中培养48 h 后，向每孔加入CCK-8 溶液（10 μl），将培养板在常规培养箱内孵育2 h，用酶标仪测定在450 nm 处的吸光度。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡 将建模完成后细胞取出，消化（0.25%的胰酶）、离心（室温2000 rpm 5 min），将收集的细胞重新悬浮一次（1×PBS 4℃）。再次离心（2000 rpm 5 min）后加入300 μl 的1×Binding Buffer洗涤细胞使沉淀细胞悬浮。加入5 μl 的Annexin VFITC，混匀，避光，室温孵育15 min。上机前5 min 再进行PI 标记，加入5 μl PI。最后上机前加入200 μl的1×Binding Buffer。

1.6 划痕实验检测细胞迁移能力 实验前1 天用黑笔于6 孔板背面画2 条黑色平行直线，消毒灭菌后备用。第2 天将实验细胞接种于6 孔板上。待细胞贴壁后，用100 μl 枪头在每个培养格里划3 条垂直于孔板背面黑线的划痕。然后将有划痕的培养格随机分为4 组，分别为N 组，S2 组（Propofol 2 μmol/L），S5组（Propofol 5 μmol/L），S10 组（Propofol 10 μmol/L）。继续常规培养48 h 后用倒置显微镜观察被黑色线所标记的划痕内不同组别肿瘤细胞迁移情况，计算细胞划痕闭合率。具体计算公式=（0 h 划痕宽度-48 h 划痕宽度）/0 h 划痕宽度。

1.7 Western blot 检测蛋白表达 裂解细胞后提取各组总蛋白，上样到凝胶上（SDS-PAGE），电泳分离蛋白。然后将电泳分离的蛋白转移到硝酸纤维素膜上（PVDF），转模完成后将膜置于5% w/v 脱脂奶粉的1×TBST 封闭缓冲液中1 h，加入一抗孵育过夜（4℃）。第2 天将膜取出，用TBST 清洗3 次以洗去未结合一抗，加入二抗室温孵育1 h，采用western blot 显影仪器曝光显影。采用Image J 软件对蛋白质条带进行灰度值的定量分析。

1.8 统计学方法 数据采用SPSS 13.0 统计软件进行分析。计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞活力（OD 值）比较 CCK-8 检测显示，S2 组、S5 组及S10 组OD 值低于N 组，差异有统计学意义（P＜0.05），且随着丙泊酚浓度的升高细胞活力降低，OD 值降低，见图1。

2.2 各组细胞凋亡情况 流式检测显示，S2 组、S5 组及S10 组细胞凋亡率和死亡率高于N 组，差异有统计学意义（P＜0.05），且随着培养皿中丙泊酚浓度的升高，细胞凋亡（早期凋亡+晚期凋亡）率和死亡率升高，见图2、表1。

图1 各组细胞活力（OD 值）比较

图2 各组细胞凋亡情况

表1 各组细胞凋亡和死亡情况（%）

2.3 各组细胞迁移情况 划痕实验显示：S2 组、S5 组及S10 组迁移率低于N 组，差异有统计学意义（P＜0.05），且随着培养皿丙泊酚浓度升高，迁移能力降低，见图3。

图3 各组迁移率比较

2.4 各组Caspase-3、VEGF 蛋白表达 蛋白免疫印迹法显示，S2 组、S5 组及S10 组凋亡相关蛋白Caspase-3 表达高于N 组，VEGF 蛋白表达低于N 组，差异有统计学意义（P＜0.05），且随着皿丙泊酚浓度升高，Caspase-3 表达量升高，VEGF 表达量降低，见图4～图7。

图4 各组Caspase-3 蛋白曝光显影比较

图5 各组Caspase-3 蛋白灰度相对比值比较

图6 各组VEGF 蛋白曝光显影比较

图7 各组VEGF 蛋白灰度相对比值比较

3 讨论

神经胶质母细胞瘤是成年人大脑肿瘤中最常见的肿瘤，恶性程度高，侵袭能力强，往往治疗效果差。近些年寻找抑制神经胶质母细胞瘤的生长、侵袭的治疗方法一直是研究的热点和难点。丙泊酚是临床常用的麻醉药物，具有明显的神经保护作用，近年来对于其抗癌作用是研究的热点。诱导肿瘤细胞凋亡是治疗癌症的创新思路，细胞凋亡是细胞自主程序性死亡，在肿瘤发生发展过程中起着重要作用，其中涉及多种基因的激活、表达以及调控[6]。Caspase-3是Caspase 凋亡蛋白家族中公认的最为重要的蛋白酶，是细胞凋亡三条通路中两条通路的交汇点，在激发细胞内源性与外源性凋亡通路中发挥着重要的作用[7]。此外，Caspase-3 的激活可诱导DNA 的降解引发细胞凋亡，当Caspase-3 活性受到抑制，细胞的增殖与凋亡就会发生紊乱，可直接或间接地促进多种肿瘤的生长[8]。研究显示[9]，Caspase-3 蛋白表达水平的高低与神经胶质瘤恶性程度及患者预后呈负相关。

Folkman J[10]于1971 年提出的“肿瘤新生血管理论”，当肿瘤直径大于2.0 mm 时，必须有新生血管为肿瘤细胞的快速繁殖提供所需的营养成分，为肿瘤细胞转移提供途径。因此，新生血管的生成是恶性肿瘤生长、浸润与转移的关键，如何抑制肿瘤新生血管生成是当前的研究热点与难点。Gee MS 等[11]研究发现，抑制肿瘤新生血管形成时，肿瘤组织内部发生缺血缺氧性改变，从而诱导大多数肿瘤细胞发生了凋亡。细胞因子（VEGF）是一种具有高度特异性的生长因子，增加血管通透性，增加血浆蛋白和蛋白纤维原的渗出，促进血管内皮细胞生长，有利于肿瘤的血管生长，可提高肿瘤细胞的侵袭和转移能力。VEGF表达量的多少与肿瘤大小、浸润程度和转移侵袭能力直接有关[12]。抑制VEGF 因子的表达，人胶质母细胞瘤的新生血管生成受到明显抑制，肿瘤血管形成减少使肿瘤细胞发生缺血、缺氧改变，促使肿瘤细胞凋亡，从而抑制肿瘤细胞的生长、侵袭和转移[13]。本研究结果显示，CCK-8 检测显示，S2 组、S5 组及S10 组OD值低于N 组，差异有统计学意义（P＜0.05），且随着丙泊酚浓度的升高细胞活力降低，OD 值降低。流式检测显示，S2 组、S5 组及S10 组细胞凋亡率和死亡率高于N 组，差异有统计学意义（P＜0.05），且随着培养皿中丙泊酚浓度的升高，细胞凋亡（早期凋亡+晚期凋亡）率和死亡率升高；划痕实验显示：S2 组、S5 组及S10 组迁移率低于N 组，差异有统计学意义（P＜0.05），且随着培养皿丙泊酚浓度升高，迁移能力降低；蛋白免疫印迹法显示，S2 组、S5 组及S10 组凋亡相关蛋白Caspase-3 表达高于N 组，VEGF 蛋白表达低于N 组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示丙泊酚可以明显抑制人神经胶质母细胞瘤的细胞活性和转移迁移能力，增加肿瘤细胞凋亡（早期凋亡+晚期凋亡）率和死亡率，考虑原因为丙泊酚通过激活Caspase-3 蛋白的表达，激发细胞内源性与外源性凋亡通路，降低肿瘤细胞活性，诱导肿瘤细胞发生凋亡和死亡，同时其还可明显抑制VEGF 的表达，以达到抑制肿瘤内血管再生，而肿瘤血管形成减少使肿瘤细胞发生缺血、缺氧改变，从而抑制肿瘤细胞的生长、侵袭和转移，甚至诱导肿瘤细胞凋亡。但丙泊酚对凋亡相关蛋白Caspase-3 和细胞因子VEGF 差异表达的具体调控机制尚未完全明了，还有待进一步研究。

综上所述，丙泊酚能降低人神经胶质母细胞瘤（U343）的活力，增加细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的增殖和迁移，且抑制程度10 μmol/L＞5 μmol/L＞2 μmol。