苏木酮A对大鼠类风湿性关节炎的治疗作用

周小清，廖理曦，姜 勇，屠鹏飞，曾克武

北京大学 天然药物与仿生药物国家重点实验室，北京 100191

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是以系统性慢性炎症为主的自身免疫性疾病[1]，其主要病理特点为关节滑膜细胞增生、滑膜衬里层增厚、多种炎性细胞浸润和大量炎症因子分泌等[2-3]，临床表现为关节疼痛、酸胀、晨僵、活动受限[4]。RA 患者若不能及时得到有效的治疗，可能出现关节畸形、残疾等现象。目前RA 的治疗药物主要为非甾体抗炎药、糖皮质激素、B 细胞抑制剂、细胞因子受体抑制剂等[5]，价格昂贵且伴有心血管和胃肠道出血、肝肾毒性和生长抑制等不良反应[6-8]，因此，开发抗RA 的天然药物尤为重要。

苏木Caesalpinia sappanL.为豆科植物苏木干燥的心材，具有活血化瘀、消肿止痛的功效。现代药理学研究表明，苏木具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、降血糖、免疫抑制等活性[9]。苏木酮A 是苏木的活性成分之一，可抑制脑部小胶质细胞活化，具有抑制神经炎症作用[10]。目前尚无苏木酮A对其他炎症模型作用的相关报道，本研究旨在探讨苏木酮A 对牛Ⅱ型胶原诱导的RA 大鼠的治疗作用，为抗RA 药物的研发提供思路。

1 材料

1.1 动物

SPF 级雄性SD 大鼠，6～8 周龄，体质量200 g，购自北京维通利华有限公司，许可证号SYXK（京）2016-0041。动物在（25±2）℃，12 h 光照/12 h 黑暗周期下适应性饲养1 周。动物实验经北京大学生物医学伦理会批准（批准号LA2015206）。

1.2 细胞

小鼠单核巨噬细胞Raw264.7 购自中国医学科学院细胞中心。

1.3 药品

苏木酮A 由本实验室合成制备，HPLC 检测其质量分数＞95%，经UV、MS、NMR 等方法确定其结构，ESI-MSm/z: 283.4 [M－H]-；1H-NMR (500 MHz,DMSO-d6)δ: 10.58 (1H,brs),9.57 (1H,brs),9.21 (1H,brs),8.24 (1H,s),7.72 (1H,d,J= 8.7 Hz),7.52 (1H,s),6.83 (2H,m),6.76 (1H,dd,J= 8.3,1.7 Hz),6.54 (1H,dd,J= 8.7,2.2 Hz),6.31 (1H,d,J=2.2 Hz),5.35 (2H,d,J= 1.6 Hz)。

1.4 试剂

DMEM 高糖培养基（批号CM15019）、无酚红DMEM 高糖培养基（批号CM15020）、青霉素-链霉素溶液（批号CC004）均购自北京中科迈晨科技有限公司；胎牛血清（批号AB-fbs0500S）购自北京百诺威生物科技有限公司；溴化噻唑蓝四氮唑（MTT，批号88417）、脂多糖（批号L8880-10）、完全弗氏佐剂（批号F5881）、不完全弗氏佐剂（批号F5506）均购自美国Sigma 公司；肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）抗体（批号60291-1-Ig）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）抗体（批号66146-1-Ig）、基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）抗体（批号10375-2-AP），均购自美国Proteintech 公司；生物素标记化山羊抗兔IgG 抗体（批号A0277）购自上海碧云天生物技术有限公司；牛Ⅱ型胶原（批号G810381）购自上海麦克林生化科技有限公司；戊巴比妥钠（批号T0894）购自美国Merck公司；TUNEL 原位细胞凋亡检测试剂盒（批号G001-2）、一氧化氮测定试剂盒（批号A013-1-1）购自南京建成生物工程研究所；IL-6 ELISA 试剂盒（批号EM004-96）购自ExCellBio 公司；二甲基亚砜（DMSO，批号D103272）购自上海阿拉丁试剂有限公司。

1.5 仪器

Sunrise-Basic 酶标仪购自瑞士Tecan 公司；IX73倒置荧光显微镜购自日本Olympus 公司；MJ-78A高压灭菌锅购自上海施都凯仪器设备有限公司；SC-237 冰箱、BC/BD-H100 冰柜购自青岛澳柯玛医疗器械有限公司；DW-86L626 超低温冰箱购自上海海尔特种电器有限公司。

2 方法

2.1 RA 大鼠模型的建立、分组与给药

根据课题组前期研究[10]，大鼠随机分为对照组、模型组、苏木酮A（50 mg/kg）组，每组6 只。牛Ⅱ型胶原溶于醋酸配制成质量浓度为2 mg/mL 的溶液，与完全弗氏佐剂按1∶1 混合配成乳剂I，与不完全弗氏佐剂按1∶1 混合形成乳剂Ⅱ。大鼠麻醉后，尾根部sc 0.1 mL 乳剂I，第7 天于尾根部sc 0.1 mL 乳剂Ⅱ，第14 天大鼠后肢红肿，踝关节体积明显增大，造模成功。苏木酮A 溶于0.5%羧甲基纤维素钠配制成质量浓度为0.5 mg/mL 的溶液。苏木酮A 组大鼠ig 药物（10 mL/kg），对照组和模型组ig 等体积生理盐水，1 次/d，连续20 d。测量大鼠右后足的足趾容积。

2.2 大鼠踝关节组织的病理分析

大鼠脱颈椎处死，取右后足，固定、脱水、石蜡包埋后切片。切片以蒸馏水漂洗，依次用苏木精、伊红染料染色；脱水后用二甲苯透明，再用中性树胶封片，于显微镜下观察大鼠踝关节组织病理变化。

切片按照TUNEL原位细胞凋亡检测试剂盒说明书进行染色后，置磷酸盐缓冲液（含0.05%聚山梨醇20）中洗涤，于显微镜下观察大鼠踝关节损伤情况。

2.3 大鼠踝关节组织中IL-6、TNF-α 和MMP-9的表达情况

踝关节组织切片用二甲苯脱蜡，用柠檬酸钠缓冲液进行抗原修复。经3%过氧化氢处理并漂洗后，用5%～10%山羊血清封闭，分别滴加IL-6、TNF-α和MMP-9 抗体并孵育，滴加生物素标记化山羊抗兔IgG 抗体并孵育，PBS 洗涤后滴加二氨基联苯胺显色液显色。苏木素复染后脱水、透明、封片，于显微镜下观察并拍照。

2.4 细胞培养

Raw264.7 细胞用高糖DMEM 培养基（含10%胎牛血清、100 U/L 青霉素、100 μg/L 链霉素）培养，每天传代1 次。

2.5 MTT 法检测Raw264.7 细胞存活率

将Raw264.7 细胞以1×104个/孔接种于96 孔板中，设置对照组、模型组和苏木酮A（2.5、5.0、10.0 μmol/L）组。苏木酮A 溶于DMSO 配制成20 mmol/L 母液，用高糖DMEM 培养基分别稀释为2.5、5.0、10.0 μmol/L 的溶液。模型组和给药组加入脂多糖（1 μg/mL），给药组另加入苏木酮A，对照组加入不含药物的高糖培养基，培养24 h。弃去上清液，加入MTT（0.5 mg/mL），孵育4 h；弃去上清液加入DMSO 溶解后，用酶标仪于570 nm 检测吸光度（A）并计算细胞存活率。

细胞存活率＝A实验/A对照

2.6 Raw264.7 细胞中一氧化氮水平测定

将Raw264.7 细胞以5×104个/孔接种于48 孔板中，设置对照组、模型组和苏木酮A（2.5、5.0、10.0 μmol/L）组。模型组和给药组加入脂多糖（1 μg/mL），给药组另加入苏木酮A，对照组加入不含药物的无酚红培养基，培养24 h。吸取上清液300 μL，按照试剂盒说明书测定一氧化氮水平。

2.7 Raw264.7 细胞中IL-6 水平测定

将Raw264.7 细胞以5×104个/孔接种于48 孔板中，设置对照组、模型组和苏木酮A（2.5、5.0、10.0 μmol/L）组。模型组和给药组加入脂多糖（1 μg/mL），给药组另加入苏木酮A，对照组加入不含药物的高糖培养基，培养8 h。吸取上清液100 μL，按照ELISA 试剂盒说明书测定IL-6 水平。

2.8 统计学分析

3 结果

3.1 苏木酮A 对RA 大鼠足容积的影响

如图1 所示，与对照组比较，模型组大鼠足容积明显增大（P＜0.01）；与模型组比较，苏木酮A组大鼠足容积显著减少（P＜0.05）。

3.2 苏木酮A对RA 大鼠踝关节滑膜组织病理变化的影响

如图2 所示，HE 染色可见模型组大鼠踝关节滑膜细胞增生、炎性细胞浸润，滑膜层相较于对照组明显增厚；苏木酮A 组大鼠踝关节滑膜形态明显恢复，相较于模型组明显变薄，炎性细胞浸润减轻。TUNEL 染色可见模型组大鼠踝关节滑膜组织出现阳性染色，提示存在细胞凋亡；苏木酮A 组TUNEL阳性染色区域减少，提示细胞凋亡受到抑制。表明苏木酮A 能改善RA 大鼠踝关节滑膜组织的损伤。

图1 苏木酮A 对RA 大鼠足容积的影响 ()Fig.1 Effect of sappanone A on foot volume in RA rats()

图2 苏木酮A 对RA 大鼠踝关节滑膜组织病理变化的影响(×10)Fig.2 Effect of sappanone A on histopathological changes of ankle synovium in RA rats (× 10)

3.3 苏木酮A 对RA 大鼠踝关节组织中IL-6、TNF-α 和MMP-9 表达的影响

如图3 所示，与对照组比较，模型组大鼠踝关节组织中IL-6、TNF-α 和MMP-9 表达升高，表明模型组大鼠踝关节组织出现炎性损伤；与模型组比较，苏木酮A 组大鼠踝关节组织中IL-6、TNF-α 和MMP-9 表达降低，表明苏木酮A 可抑制RA 大鼠炎性因子的表达。

3.4 苏木酮A 对Raw264.7 细胞存活率的影响

如图4 所示，苏木酮A（2.5、5.0、10.0 μmol/L）组Raw264.7 细胞存活率均大于80%。

3.5 苏木酮A 对脂多糖诱导的Raw264.7 细胞一氧化氮和IL-6 水平的影响

图3 苏木酮A 对RA 大鼠踝关节组织中IL-6、TNF-α 和MMP-9 表达的影响Fig.3 Effect of sappanone A on expressions of IL-6,TNF-α and MMP-9 in ankle joint tissue of RA rats

如图5 所示，与对照组比较，模型组一氧化氮和IL-6 水平显著增加（P＜0.01）；与模型组比较，苏木酮A（2.5、5.0、10.0 μmol/L）显著抑制一氧化氮和IL-6 水平（P＜0.01），呈剂量相关性，表明苏木酮A 可抑制脂多糖诱导的炎症。

图4 苏木酮A 对脂多糖诱导的Raw264.7 细胞活性的影响()Fig.4 Effect of sappanone A on viability of Raw264.7 cells induced by lipopolysaccharide ()

图5 苏木酮A 对脂多糖诱导的Raw264.7 细胞一氧化氮和IL-6 水平的影响 ()Fig.5 Effect of sappanone A on levels of nitric oxide and IL-6 in Raw264.7 cells induced by lipopolysaccharide ()

4 讨论

RA 疾病发展迅速，如果患者在早期不能得到有效治疗，则可能恶化成疾。RA 病理特征表现为关节肿胀、滑膜细胞增生、炎症因子大量释放[2-3]。成纤维样滑膜细胞是RA 患者滑膜组织中的主要细胞类型之一，被认为是治疗RA 的有效靶点[11-14]。因此，抑制滑膜细胞增生可作为治疗RA 的指标之一。促炎细胞因子IL-6 和TNF-α 作为重要的炎症介质参与机体的炎症反应，可作为RA 的评价指标。MMP-9 具有降解和再塑造细胞外基质的功能，参与机体中多种病理和生理过程[15]。MMP-9 的表达与活化可促进RA 中炎症细胞浸润，参与患者骨组织的侵蚀和破坏[16]。

苏木酮A 是从苏木中发现的抗炎活性成分，课题组前期研究发现其具有良好的抑制神经炎症作用。本研究发现苏木酮A 能有效抑制牛Ⅱ型胶原蛋白诱导的RA 大鼠足肿胀、踝关节滑膜组织损伤和炎症反应，其机制可能为抑制滑膜组织细胞凋亡、成纤维细胞增殖和炎症因子释放；苏木酮A 能显著降低脂多糖诱导的Raw264.7 细胞中炎性介质一氧化氮和IL-6 的分泌，表明苏木酮A 的抗RA 作用与抑制炎症因子生成有关。本研究从体内外探讨了苏木酮A 对RA 的治疗作用，为抗RA 药物的开发提供了参考。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突