壳聚糖对腐生葡萄球菌的作用机制

蓝蔚青，杨 歆，王 蒙，梅 俊，谢 晶

（1.上海海洋大学食品学院// 2.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心// 3.食品科学与工程国家级实验教学示范中心（上海海洋大学），上海 201306）

水产品在贮藏期间，微生物是导致其腐败的主因[1]。微生物种群发生群落演替，其中部分优势菌起主导作用，产生腐败臭味和异味等代谢产物，称之为该类水产品的特定腐败菌（Specific Spoilage Organism，SSO）[2]。SSO 具有调节和代谢产生一系列化合物与生物活性物质的能力，还可能含有从鱼体内非蛋白氮衍生出的各种有机挥发性化合物（volatile organic compounds，VOCs），产生异味，影响产品的感官、质地与新鲜度[3-4]。腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）为革兰阳性菌，是大黄鱼（Pseudosciaena crocea）贮藏后期的SSO，能分泌蛋白酶与脂肪酶，导致蛋白质降解与脂质氧化，影响其品质[5-6]。目前有部分学者开展了对腐生葡萄球菌作用机理分析，如苏萌萌等[7]研究得出绿原素能使腐生葡萄球菌细胞膜受损，导致膜电位变化，胞内物质泄漏；朱亚珠等[8]发现山梨酸钾、异抗坏血酸钠与双乙酸钠复合保鲜剂能明显抑制腐生葡萄球菌的生长速率，导致菌体核酸与蛋白质外泄。本课题组前期在生物保鲜剂对腐生葡萄球菌的作用机制方面也开展了部分研究工作[9-11]。

壳聚糖是一种天然的阳离子多糖，是甲壳质的脱乙酰产物。其无毒、抗菌活性、可生物降解性和生物相容性、成膜性等优势能够提高产品的综合品质，延长其货架期[12-14]。此外，壳聚糖还可与具有抗氧化、抗菌或其他活性的功能化合物结合使用，以提升其综合作用效果[15-16]。由于壳聚糖对革兰阳性和革兰阴性细菌具有高效广谱的杀灭效果，一直受到研究者的关注，具有较大的商业潜力。近年来，国内外研究学者发现壳聚糖在抑菌方面有着显著的效果，李佳艺等[17]研究得出壳聚糖，茶多酚和溶菌酶复合保鲜可有效减缓鱼肉品质变化；Vivek 等[18]使用壳聚糖介导的绿色合成法制备稳定银纳米粒子与聚乙烯醇共混，形成静电纺纤维复合纳米层，得出此复合材料能抑制包装食品的微生物降解，延长食品保质期一周。学者还探讨了壳聚糖对微生物的作用机制，其中李小芳等[19]研究发现细胞膜是壳聚糖对金黄色葡萄球菌作用的主要位点，壳聚糖通过改变细胞膜的渗透性使细胞膜破坏，伴随大量细胞内容物泄露；柯松等[20]分析了壳聚糖的抑菌性能，发现壳聚糖在特定分子量、特定pH 时，针对某种菌时会有最适抑菌浓度，超过该浓度，壳聚糖的抑菌效果将不会增强，甚至可能下降。然而，目前还未见有壳聚糖对腐生葡萄球菌作用机制的研究报道。

本研究通过测定壳聚糖对腐生葡萄球菌的最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC），随后通过分析微生物生长曲线、电导率值、过氧化氢酶（Catalase，CAT）含量、苹果酸脱氢酶（Malate dehydrogenase，MDH）含量与生物膜生成量等指标的变化，结合扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope，SEM）观察壳聚糖作用后腐生葡萄球菌微观结构的变化，综合评价壳聚糖对腐生葡萄球菌的作用机制，以期为壳聚糖更好应用于水产品保鲜提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

腐生葡萄球菌（S.saprophyticus）由上海海洋大学水产品加工与贮藏工程技术研究中心分离纯化，鉴定后于-80 ℃超低温下甘油管冻存。

壳聚糖（白色粉末，脱乙酰度为90%，分子质量70～ 80 ku），上海维编科技有限公司；聚四氟乙烯（poly tetra fluoroethylene，PTFE）膜过滤器，生工生物工程（上海）股份有限公司；胰蛋白胨大豆肉汤（Tryptic Soy Broth，TSB）培养基，青岛海博生物技术有限公司；考马斯亮兰蛋白测定试剂盒、碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，AKP）测试盒、过氧化氢酶（Catalase，CAT）与苹果酸脱氢酶（Malate dehydrogenase，MDH）试剂盒，南京建成生物工程研究所；氯化钠、无水乙醇、戊二醛等均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

DDB-11A 型电导率仪，杭州齐威仪器有限公司；ZQZY-70B 型振荡培养箱，上海知楚仪器有限公司；Synergy2 型自动酶标仪，美国BioTek 公司；QYC-200 型全温培养摇床，上海新苗医疗器械制造有限公司；Centrifuge 5810R 型冷冻离心机，德国Eppendorf 公司；DNP-9162BS-型电热恒温培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；UV-2450 型紫外可见分光光度计，日本岛津公司；LDZM-40KCS型立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；MIRAFE-SEMs 型分析型高分辨扫描电镜，捷克Tescan 公司等。

1.3 方法

1.3.1 菌悬液与壳聚糖溶液制备 菌悬液制备：参考蓝蔚青等[11]方法，将腐生葡萄球菌菌种从-80 ℃冰箱中取出，在胰蛋白胨大豆琼脂（tryptic soy agar，TSA）平板上划线，30 ℃培养24 h。随后，挑取单菌落在10 mL 胰蛋白胨大豆肉汤（trypticase soy broth，TSB）中，在37 ℃、150 r/min 恒温摇床活化培养18 h；再以体积分数1%的接种量接入10 mL的TSB 中，37 ℃、200 r/min 振荡培养18 h，经5 000 r/min、4 ℃离心10 min，收集菌体后弃去上清液，用质量分数0.85%生理盐水重悬，调节菌悬液浓度为106CFU/mL，4 ℃保存备用。

壳聚糖溶液制备：用体积分数1%乙酸为溶剂溶解壳聚糖，配制成不同浓度的壳聚糖溶液，通过0.22 μm PTFE 膜过滤器过滤灭菌待用。

1.3.2 最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）测定 参照王小敏等[21]的方法，采用微量肉汤稀释法测定壳聚糖对腐生葡萄球菌的MIC。由二倍稀释法将壳聚糖液梯度稀释，使其最终质量浓度分别为20、10、5、2.5、1.25、0.625与0.312 5 mg/mL，依次将不同浓度的壳聚糖加入菌液，并混和均匀。将加样后的96 孔板于37 ℃恒温培养箱中静置培养24 h，用酶标仪测定D（600 nm）值，孔内细菌生长被完全抑制的最低样品浓度即为该样品的MIC。随后，结合D值和孔液澄清情况选出最澄清的3 个所代表的壳聚糖溶液浓度，将己制备的供试菌菌悬液分别接入3 支灭菌后的TSB 试管中。混匀后将试管置于37 ℃、150 r/min 摇床上振荡培养24 h，同时从3 支试管中各吸取100 μL 在TSA 平板上涂布后培养，以不加入壳聚糖溶液的菌液为对照组。

1.3.3 微生物生长曲线绘制 将己制备的供试菌菌悬液分别加至MIC、2MIC 壳聚糖溶液中，以无菌水处理组为对照。37 ℃、150 r/min摇床培养24 h，每1 h 取样，测定其D（600 nm）值，实验重复3次。以时间（h）为横坐标，D值为纵坐标，绘制壳聚糖对腐生葡萄球菌的生长曲线影响。

1.3.4 电导率值测定 采用卢晓等[22]的方法，稍作修改。将己制备的供试菌菌悬液分别加至MIC、2MIC 壳聚糖溶液中后继续培养，每2 h 取样一次。将1 mL 培养液4 000 r/min 离心10 min，上清液稀释20 倍后，用电导率仪测定其电导率，以不加壳聚糖为对照，实验重复3 次。

1.3.5 碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，AKP）含量测定 将己制备的供试菌菌悬液分别加至MIC、2MIC 壳聚糖溶液中，以37 ℃、150 r/min培养12 h，每2 h 取样一次，取2 mL 细菌溶液置于离心机中，4 ℃、4 000 r/min 离心10 min，取上清液，按AKP试剂盒说明书进行碱性磷酸酶含量测定，以不加壳聚糖为对照，重复测定3 次。

1.3.6 过氧化氢酶（Catalase，CAT)含量测定 参考廖石榴等[23]的方法，将己制备的供试菌菌悬液分别加至MIC、2MIC 壳聚糖溶液中，以37 ℃、150 r/min 培养12 h，每2 h 取样一次，取10 mL 悬浮液低温超声2 min 后，4 ℃、4 000 r/min 离心12 min，取上清液，按CAT 试剂盒说明书进行酶含量测定，以不加壳聚糖为对照，重复测定3 次。

1.3.7 苹果酸脱氢酶（Malate dehydrogenase，MDH）含量测定 参考周磊等[24]的方法，稍作修改。将己制备的供试菌菌悬液分别加至MIC、2MIC 壳聚糖溶液中，以37 ℃、150 r/min 培养12 h，每2 h 取样一次，取2 mL 悬浮液4 ℃、3 000 r/min 离心15 min，弃上清液，用Tris-HCl（0.1 mol/L，pH 7.4）洗涤3 次，再加入等体积溶菌酶（2.0 g/L），38 ℃静置15 min，待菌体发黏时冰浴，再加入Tris-HCl，5 000 r/min 离心12 min，取上清液按CAT 试剂盒说明书进行酶含量测定，以不加壳聚糖为对照，重复测定3 次。

1.3.8 生物膜生成量测定 将制备好的菌悬液与TSB 培养基按体积比1∶3 的比例加入96 孔板中，每孔200 μL，在28 ℃条件下培养48 h，取出孔板，弃去浮游菌，用250 μL 无菌生理盐水清洗2 次，然后60 ℃干燥固定30 min，每孔加入体积分数0.1%的结晶紫溶液200 μL，染色5 min 后，用250 μL 无菌生理盐水清洗3 次，干燥，再加入体积分数33%的冰乙酸200 μL，放置10 min，用酶标仪测D（595 nm）值。

1.3.9 扫描电镜分析 参考Xu 等[25]方法测定腐生葡萄球菌细胞结构变化。将己制备的供试菌菌悬液分别加至MIC、2MIC 壳聚糖溶液中，以37 ℃、150 r/min 振荡7 h 后，得到进入生长对数期的菌液。将一定量的细菌溶液以4 000 r/min 离心4 min，弃去上清液。细胞用pH 7.4 磷酸盐缓冲液（Phosphate buffer solution，PBS）进行3 次洗涤，在4 ℃冰箱中用体积分数2.5%戊二醛固定4 h。以不同体积分数乙醇（30%、50%、70%、90%、100%）依次脱水，并置于-80 ℃冰箱中冷冻保存4～8 h 后，冷冻干燥24 h。最后涂在金属箔上固定并喷金，在扫描电镜下观察细胞形态。

1.4 数据处理

数据用软件Origin（Pro）8.5 绘制曲线，数据间差异通过统计软件SPSS13.0 中的Duncan 新复极差法进行方差分析与多重比较，结果以平均值±标准偏差表示。实验数据由3 次平行实验平均值获得。

2 结果与分析

2.1 最小抑菌浓度MIC 确定

通过前期对菌悬液的D（600 nm）值测定，并结合菌悬液澄清度变化情况（表1）可知，0 h，对照组菌液澄清，处理组菌液呈现壳聚糖溶液原色；12 h，对照组菌液混浊，表明腐生葡萄球菌已进入对数期，而2.5、1.25 与0.625 mg/mL 壳聚糖处理组试管中的菌液变得澄清；培养24 h 后，可观察到对照组菌液的混浊程度加深，表明菌体已进入稳定期，代谢产物随之积累，此时0.625 mg/mL 壳聚糖管已混浊。由后期3 个浓度加入壳聚糖处理组菌液涂布平板培养的最终结果判断得出壳聚糖对腐生葡萄球菌的MIC 为1.25 mg/mL。

表1 壳聚糖对腐生葡萄球菌生长的作用效果Table 1 Effects of chitosan on the growth of Staphylococcus saprophyticus

2.2 壳聚糖处理对微生物生长曲线的影响

将MIC 与2MIC 壳聚糖液加入腐生葡萄球菌菌液中，对该菌的生长曲线影响如图1 所示。

图1 表明，处理组和对照组的细菌生长遵循“S”型生长曲线。对照组的腐生葡萄球菌在2 h 后开始进入对数生长期，12 h 后达到稳定期。而MIC 处理下的腐生葡萄球菌在6 h 后开始进入对数期，同时2MIC 下的腐生葡萄球菌仍处于调整期，且在9 h后进入对数期，表明壳聚糖能显著抑制腐生葡萄球菌的生长（P＜0.05）。可能是因为壳聚糖属于氨基多糖，一定程度上能为菌体生长提供营养，当抑制作用在交互中占主导地位时，使菌体生长受抑；而当壳聚糖作为其促进生长的必要营养时，抑制作用相对减弱[26]。

2.3 壳聚糖对碱性磷酸酶AKP酶含量的影响

碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，AKP）位于细胞壁和细胞膜间，当细胞壁遭到破坏，AKP被释放到胞外，因而可通过测定AKP含量来表征壳聚糖对细胞壁的损伤程度[9]，其变化过程如图2所示。

图1 壳聚糖处理对腐生葡萄球菌生长曲线影响Fig.1 Effects of chitosan on the growth curve of Staphylococcus saprophyticus

图2 壳聚糖对腐生葡萄球菌AKP酶含量变化的影响Fig.2 Effects of chitosan on the AKPase content of Staphylococcus saprophyticus

图2 表明，腐生葡萄球菌经壳聚糖处理后，其AKP酶含量明显高于对照组，且AKP酶含量高低与壳聚糖浓度呈正比。可见，腐生葡萄球菌经壳聚糖处理后，引起细胞壁的损伤，使细菌细胞壁的通透性与完整性发生改变。AKP酶暴露在膜外，膜的作用被削弱而发生质壁分离，壁膜结构被破坏，细菌失去细胞壁的保护，胞内内容物泄漏而死亡。其中，Raafat 等[27]研究得出革兰阳性菌的细胞壁成分糖脂质——脂壁酸可为壳聚糖在细胞表面提供分子连接，进一步干扰菌体的膜功能。

2.4 壳聚糖对电导率值的影响

细胞内成分渗漏是细菌细胞质膜受损的决定性标志，反映菌体细胞膜的通透性变化[28]。

由图3 可知，随着处理时间的延长，各组处理液的电导率值均有所升高，而与对照组相比，MIC 和2MIC 处理的菌悬液电导率明显增加（P＞0.05）。表明壳聚糖处理可使腐生葡萄球菌细胞悬液的电导率值升高，可能是因为壳聚糖对菌体细胞膜通透性产生影响，导致细胞电解质渗漏，抑制其正常生长代谢，造成菌体死亡。其中MIC 处理组电导率值在4～6 h 处下降，参照图1 中腐生葡萄球菌生长曲线，可能由于MIC 处理组在4～6 h 腐生葡萄球菌处于延滞期，细胞吸收胞外电解质如K+、Ca2+为对数生长期作准备。从而导致电导率下降，而2MIC组，由于其对腐生葡萄球菌破坏力较强，因而不受影响。与此同时，对照组组菌悬液的电导率值也在缓慢增加，可能由于菌体的自然衰老、死亡引起膜通透性变差。此结果与菌体的生长曲线变化趋势保持一致。

图3 壳聚糖对腐生葡萄球菌电导率值变化的影响Fig.3 Effects of chitosan on the electrical conductivities of Staphylococcus saprophyticus

2.5 壳聚糖对过氧化氢酶（CAT）含量的影响

细胞膜的损伤和酶的失活可能会严重影响细胞代谢[29]。CAT 是细胞内的保护酶，具有清除活性氧自由基，保证细胞膜结构完整度的功能。

图4 表明，未经壳聚糖处理过的腐生葡萄球菌的CAT 含量总体保持较高水平，在培养6 h 达到最高峰，参照图1 中腐生葡萄球菌的生长曲线，这可能是因为在0～6 h，腐生葡萄球菌属于对数生长期，细胞代谢产生大量过氧化氢，细菌调控后产生大量CAT，而后腐生葡萄球菌滴度趋于稳定，CAT 含量下降后保持稳定。而MIC 与2MIC 处理下的菌体CAT 含量在2 h 后快速下降，且在此后保持缓慢降低，到12 h 时两者基本一致。这可能是因为壳聚糖的大分子结构在处理初期不易进入菌体细胞内，后经破坏细胞壁和细胞质膜进入细胞内，破坏保护酶系统，最终导致细胞菌体死亡。

图4 壳聚糖对腐生葡萄球菌CAT 酶含量变化的影响Fig.4 Effects of chitosan on the CAT content of Staphylococcus saprophyticus

2.6 壳聚糖对苹果酸脱氢酶（MDH）含量的影响

MDH 是三羧酸循环中关键酶类之一，其酶含量变化可直接反映出细胞的能量代谢情况[30]。由图5 可知，细菌培养2 h 后，相比于对照组菌悬液11.96 U/mg酶活力，壳聚糖处理组的MDH含量降低67%，表明壳聚糖对腐生葡萄球菌MDH 有明显抑制作用。同时，壳聚糖浓度对MDH 含量无显著影响（P＞0.050）。酶含量变化反映了腐生葡萄球菌对糖的氧化代谢被抑制，使菌体生长繁殖受到阻碍[23]。

2.7 壳聚糖对生物膜生成量的影响

生物膜是一个微生物群落，其聚集在一起并附着在同一表面上，形成由胞外聚合物（Extracellular polymeric substances，EPS）组成的自生保护层[31]。由图6 可知，与对照组相比，MIC 组D（595 nm）值下降37.10%，2MIC 组D（595 nm）值下降67.74%，即随着壳聚糖浓度的增大，抑制率明显升高，表明壳聚糖对腐生葡萄球菌的生物膜形成能力有较好抑制作用。

图5 壳聚糖对腐生葡萄球菌MDH 酶含量变化的影响Fig.5 Effects of chitosan on the MDH content of Staphylococcus saprophyticus

图6 壳聚糖对腐生葡萄球菌生物膜形成能力的影响Fig.6 Effects of chitosan on the biofilm formation of Staphylococcus saprophyticus

2.8 壳聚糖处理前后腐生葡萄球菌微观结构

由图7 可知，未经处理的腐生葡萄球菌细胞呈现正常形态且饱满；然而，经壳聚糖处理的腐生葡萄球菌培养7 h 后，细胞形状不规则，表面呈不规则皱褶，出现破损细胞或细胞碎片，黏附聚集明显。以上变化表明，壳聚糖破坏了腐生葡萄球菌的外部结构，导致蛋白质、核酸等细胞质成分的泄漏。蓝蔚青等[32]通过扫描电镜观察ε-聚赖氨酸处理腐生葡萄球菌，发现其可使细菌体表粗糙、扭曲变形与细胞相互黏结。

图7 腐生葡萄球菌经壳聚糖处理前后的扫描电镜Fig.7 Scanning electron micrographs of staphylococcus saprophyticus before and after treatment with chitosan

2.9 壳聚糖对腐生葡萄球菌作用分析

综合如上指标分析结果，壳聚糖对腐生葡萄球菌作用机制如图8 所示。

图8 壳聚糖对腐生葡萄球菌作用机制示意Fig.8 Action mechanism of chitosan on Staphylococcus saprophyticus

由图8 可见，壳聚糖的作用位点多样，其可改变细胞膜通透性，对细胞中的CAT 酶、三羧酸循环、能量代谢产生干扰，导致AKP酶、核酸及蛋白质泄漏，使其DNA 结构的改变，干扰群体感应分子，使其失活，这解释了本研究结果中CAT 酶与MDH含量降低，AKP酶含量和电导率值上升，同时扫描电镜结果中壳聚糖处理后腐生葡萄球菌的外部结构遭到破坏。然而，壳聚糖对菌体细胞膜、信号分子的分泌与接收、能量代谢与物质循环、增殖与传代等影响仍需深入研究，正如本研究中壳聚糖处理组明显降低腐生葡萄球菌的生物膜生成量。该研究结果与RAI M 等[32]综合分析结果相似；同时，在菌体外部普遍存在的胞外基质（extracellular matrix，ECM）中，作为群体感应系统中关键因素的AHLs等信号分子及胞外多糖（extracellular polysaccharide，EPS）在不同菌种间的差异性可能也会对不同菌株对壳聚糖的耐受力产生一定影响。因此，后期可通过群体感应机制研究，深入探究壳聚糖对水产品特定腐败菌的作用机制。

3 结论

本研究探究壳聚糖处理对腐生葡萄球菌的作用机制，测定，其对腐生葡萄球菌的MIC 为1.25 mg/mL，经菌体经MIC 和2MIC 处理后，CAT 与MDH 含量降低，电导率值上升，对腐生葡萄球菌的生长曲线产生较大影响，且使腐生葡萄球菌的生物膜生成量明显降低。扫描电子显微镜观察发现，经壳聚糖处理的腐生葡萄球菌细胞形状不规则，表面呈不规则皱褶，出现破损细胞或细胞碎片，黏附聚集明显，严重时导致蛋白质、核酸等细胞质成分泄漏。壳聚糖能延缓腐生葡萄球菌的生长，抑制菌体生物膜的形成，损坏细胞壁结构，增强其细胞膜通透性，随后进入细胞内，破坏保护代谢的酶系统，最终导致细胞死亡。