田口法优化石榴皮中3种活性成分的提取工艺

李佳璇，赵姗姗，盛尊来,

1. 东北农业大学动物医学学院（哈尔滨 150030）；2. 黑龙江省重点实验室，动物疾病防控技术与制剂创制实验室（哈尔滨 150030）

石榴（Punica granatumL.）是石榴科植物石榴的果实，原产于波斯一带，开辟“丝绸之路”的张骞出使西域时将石榴种子带回中国并种植，现在主产于江苏、湖南、湖北、山东等地[1-3]。中国是石榴的第一生产和消费国，石榴果实、果皮、根、花均可入药[4]。

石榴皮是石榴的干燥果皮，含有许多生物活性成分，如多酚类、黄酮类、有机酸、生物碱类等[5-9]。石榴皮是中国传统中药，有涩肠止泻、止血驱虫的功效，用于治疗烧伤烫伤，痢疾，中耳炎、牛皮癣及甲状腺癌、肝癌等多种癌症[10-16]。

田口法是日本著名质量管理学家田口玄一博士提出的一种质量工程的方法。田口法充分利用系统中存在的非线性效应，选择合适的正交设计表安排试验，通过S/N分析和方差分析对测试结果进行分析，通过田口正交试验确定影响因素的重要性和各因素的最佳水平并加以组合，利用误差模拟干扰因素，设计更加科学，提高效率，降低费用[17-19]。单因素试验基础上，使用田口法优化安石榴林、安石榴苷、鞣花酸的提取工艺，为工业生产提供依据，有助于石榴皮的进一步开发利用。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

石榴皮是（哈药集团世一堂制药厂）；安石榴林、安石榴苷和鞣花酸对照品（纯度≥98%，中国药品生物制品检定所；乙醇（广州友联化工试剂有限公司）；甲酸（色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司）；甲醇（色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司）；超纯水由Milli-Q Academic超纯水系统（自制，Millipore，Bedford，MA，USA）；娃哈哈矿泉水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

1.2 仪器和设备

Waters e2695高效液相色谱仪（上海沃特世科技有限公司）；Gemini C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美国Phenomenex分析仪器有限公司）；KAT-8循环水多用真空泵（无锡中恒仪器厂）；TGL-16G高速台式离心机（上海利鑫坚离心机有限公司）；DH6000A电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；BT224S分析天平（深圳明科科技有限公司）。

1.3 色谱条件

高效液相色谱仪器采用2998 PDA检测器，流动相由0.1%甲酸（A）和甲醇（B）组成，梯度洗脱分离程序：0 min（5% B）×8 min（16.3% B）×17 min（20.5% B）×47 min（62.8% B）。流速1.0 mL/min，进样量10 μL，柱温30 ℃，检测波长377 nm。

通过比较其保留时间和标准溶液中相应峰的保留时间确定石榴皮中的安石榴林、安石榴苷和鞣花酸（见图1）。表1列出这些标准曲线的相关系数和线性范围。

图1 高效液相色谱图

表1 安石榴林、安石榴苷和鞣花酸的标准曲线回归方程和线性范围

1.4 安石榴林、安石榴苷和鞣花酸的提取

将石榴皮（5.00 g）研磨成粉末后过筛，乙醇回流提取。过滤使药渣与提取液分离，提取液以3 000 r/min离心10 min，用高效液相色谱法测定其含量。

1.5 田口法优化提取工艺

在单因素试验条件下，初步确定乙醇体积分数（A）、提取温度（B）、提取时间（C）、液料比（D）和粒径（E）的适宜范围。在单因素试验基础上，设计五因素三水平L27(35)的田口法试验，因素水平表如表2所示。整个设计包括27次试验点，随机进行。信噪比S/N计算如式（1）。

式中：n为每个试验的测量次数；S/N为信噪比；y为提取率。

表2 田口设计的因素和水平

1.6 统计分析

用Minitab 17软件分析田口法的信噪比和方差分析结果。用图基法检验各因素的显著性（p＜0.05）。

2 结果和分析

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇体积分数对安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率的影响

试验考察温度40 ℃、时间1 h、液料比20∶1 mL/g、粒径0.25 mm、提取次数1次时，不同浓度的乙醇（0，20%，40%，60%，80%和100%）对安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率的影响。

结果如图2A所示，乙醇体积分数从0升高到20%时，提取率呈线性下降，而乙醇体积分数继续增加时，提取率保持不变。

这是因为安石榴林、安石榴苷和鞣花酸中含有大量苯基、羟基，易溶于极性溶剂。3种成分在乙醇体积分数0%时达到最大值。根据这一结果，选择0～20%乙醇体积分数进一步优化。

2.1.2 提取温度对安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率的影响

试验考察乙醇体积分数0%、时间1 h、液料比20∶1 mL/g、粒径0.25 mm、提取次数1次时，不同的提取温度（30，40，50，60，70和80 ℃）对安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率的影响。

结果如图2B所示，随着提取温度升高，安石榴林，安石榴苷和鞣花酸产量先升高后下降，安石榴苷产量在70 ℃达到最大值，而安石榴林和鞣花酸产量在40 ℃达到最大值。由于石榴皮中安石榴苷含量远远高于安石榴林和鞣花酸，因此，将提取温度设定在70 ℃并进行下面的田口试验。

2.1.3 提取时间对安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率的影响

试验考察乙醇体积分数0、提取温度70 ℃、液料比20∶1 mL/g、粒径0.25 mm、提取次数1次时，不同的提取时间（0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 h）对安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率的影响。

结果如图2C所示，安石榴林、安石榴苷和鞣花酸的提取率都在提取时间2.0 h时达到最大值，并随着提取时间继续延长而降低。据推断，在这种情况下，3种成分已充分溶解和吸收，可用于临床。

这是因为提取时间2.0 h时，3种酚酸溶解饱和，溶解速率处于平衡状态，但随着提取时间继续增加，酚酸类物质可能发生缩合、降解、氧化或其他化学反应，影响目标化合物产率。因此，在1.5～2.0 h范围内确定提取时间，用田口法进一步优化。

2.1.4 液料比对安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率的影响

试验考察乙醇体积分数0%、提取时间2 h、提取温度70 ℃、粒径0.25 mm、提取次数1次时，不同液料比（10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1和60∶1 mL/g）对安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率的影响。

结果如图2D所示，随着液料比从10∶1 mL/g增加到40∶1 mL/g，3种化合物提取率均有所提高，而液料比从40∶1 mL/g增加到60∶1 mL/g，提取率不再继续增加。

这是因为随着溶剂体积增加，物料与溶剂的接触面积增大，浓度增加梯度变大，溶质转移的动力增大，有利于3种酚酸的溶解。酚酸浸出达到饱和点时，产量不再增加，直到达到一定值时，产量40 mL/g时达到最高水平。与此结果相对应，田口法采用液料比30～50 mL/g进一步优化。

2.1.5 粒径对安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率的影响

试验考察乙醇体积分数0%、提取时间2 h、提取温度70 ℃、液料比40∶1 mL/g、提取次数1次时，不同粒径对安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率的影响。

结果如图2E所示，粒径（0.09～2 mm）对提取效果明显，提取率随粒径减小而升高，在0.125 mm时提取率达到最大值。

这可能是因为当粒径较小时，目标化合物能更好地从石榴皮粉中分离出来。试验结果与前期研究一致，表明最佳粒径为0.09～0.15 mm，并采用田口法进一步优化。

2.1.6 提取次数对安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率的影响

试验考察在最佳提取条件下（乙醇体积分数0%、提取时间2 h、提取温度70 ℃、液料比40∶1 mL/g，粒径0.125 mm）时，不同提取次数（1，2，3和4次）对安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率的影响。

结果如图2F所示，提取次数从1次增加到2次时，提取率明显提高。但3次提取后，提取率变化不明显。

图2 不同提取因素对3种酚酸产率的影响

这是因为随着提取次数增加，溶液体积明显增大，会影响后续的集中度，造成功率损耗，增加许多不必要的成本。因此，选择提取2次用于田口法优化。

2.2 田口法进一步优化乙醇回流提取工艺

基于单因素试验结果，利用统计分析软件Minitab 17，将5个因素——乙醇体积分数（A）、提取温度（B）、提取时间（C）、液料比（D）和粒径（E），以及3水平——安石榴林（Y1）、安石榴苷（Y2）和鞣花酸（Y3），采用L27(35)田口法中心组合试验设计进行研究。田口法试验设计和安石榴林、安石榴苷和鞣花酸的提取率如表3所示。

为探究各个变量对安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率的显著影响，对田口法的试验数据进行方差分析[20]。p值决定工艺因素是否具有统计学意义[21]。设显著性p＜0.05，如表4所示，对比F值，乙醇体积分数（A）、提取温度（B）和粒径（E）是对安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率影响最大的3个变量。3个因素对提取率的影响依次为B＞A＞E，R2和调整后的R2值均接近1，说明提取率模型成立。

为使用信噪比S/N分析这些数据，确定最佳提取条件如图3所示。使用Minitab 17软件不能简单地统计优化每个组分的最大产量。对3个水平的结果进行综合比较分析：1）乙醇体积分数。安石榴林和安石榴苷的提取率在水平3达到最大，鞣花酸的提取率在水平1和水平3基本相同，因此最佳乙醇体积分数是水平3。2）提取温度。最大产量安石榴林和鞣花酸的最大提取率均在水平3，但安石榴苷的最大提取率为水平2，由于3种成分中安石榴苷的含量最高，因此最佳提取温度是水平2。3）提取时间。鞣花酸的最大提取率在水平2，安石榴林和安石榴苷的提取率在水平2和水平3基本相同，因此最佳提取时间在水平2。4）液料比。安石榴林、安石榴苷和鞣花酸在水平3的提取率最高，因此最佳液料比为水平3。5）粒径为水平2，安石榴苷和鞣花酸的最高提取率为水平2，最佳液料比为水平2。6）粒子直径。安石榴苷和鞣花酸在水平2的提取率最高，因此最佳粒子直径是水平2。

综上所述，最佳提取条件为A3B2C2D3E2（乙醇体积分数20%、提取温度70 ℃、提取时间2 h，液料比50∶1 mL/g、粒径0.125 mm、提取次数2次）。在此条件下，安石榴林、安石榴苷和鞣花酸的预测提取率分别为17.94，497.44和7.26 mg/g。在最优化条件下，进行3次验证性试验。结果见表5，3次试验平均提取率分别为安石榴林17.89±0.27 mg/g，安石榴苷498.66±2.13 mg/g和鞣花酸7.30±0.05 mg/g，与预测值基本一致，说明工艺优化合理可行。

表3 田口试验设计及相应的安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率

表4 方差分析（ANOVA）

表5 优化条件下的验证性试验

图3 不同水平田口试验设计对3种酚酸提取率的影响信噪比均数分析图

3 结论

在单因素试验基础上，利用田口法得到提取石榴皮中安石榴林、安石榴苷和鞣花酸的最佳提取工艺为乙醇体积分数20%、提取温度70 ℃、提取时间2 h、液料比50∶1 mL/g、粒径0.125 mm，提取次数2次。结果表明，采用田口法建立的提取优工艺模型合理，方法可行，可用于批量生产。