3500MHz急性电磁辐射对豚鼠焦虑行为及听皮层的影响

杨红红 左汶奇 罗小莉 钟时勋

重庆医科大学附属第一医院，耳鼻咽喉科（重庆 400016）

手机产生的电磁辐射（electromagnetic radiation，EMR）已成为影响人们生活健康的一个重要污染源。联合国人类环境会议已将EMR列为必须控制的公害之一[1]。关于手机对人体的影响，目前有学者发现长期使用手机会降低精子活力影响生育[2,3]，增加听神经瘤的患病风险[4]，还有大量流行病学研究表明，长期使用手机人群常常有头痛、睡眠障碍、疲劳、认知障碍、记忆力下降、头晕和抑郁等不良反应[5,6]。

手机EMR对人体的影响是目前研究的热点，衡量EMR强度的常用指标有频率和比吸收率（Specific absorption rate，SAR）。1800MHz（4G）是目前全球移动通信系统常用的频率，而3500MHz是5G移动通讯的频率，即将广泛应用。SAR指单位时间内单位质量物质吸收的EMR能量，其单位是w/kg，通常被用来衡量手机电磁辐射的强弱。美国、欧洲和国内标准SAR值通常设置上线为2w/kg，但部分职业暴露时可达到10w/kg[7]。

双耳和大脑是手机EMR的直接效应器官，也是暴露时间最长的器官，但关于手机EMR对听觉器官影响的研究目前仍存在争议。听皮层是感知外界信号的高级神经中枢，在信号处理加工过程中起着重要作用[8]。EMR对听觉系统的研究多集中于耳蜗，如导致耳蜗边缘细胞活性氧生成增加[9]，螺旋神经节细胞自噬小体生成[10]，支持细胞及毛细胞的凋亡和坏死[11]，但对听皮层的影响研究较少。旷场实验是用于评价动物在新异环境中自主行为、探索行为与紧张度的一种方法，是检测动物焦虑行为的一种常见的经典实验方法[12]。因此，本课题组拟在动物模型的基础上，探讨3500MHz（5G）辐射频率，SAR在2w/kg、4w/kg和10w/kg模式下，观察辐射前后听力阈值和旷场行为指标变化，听皮层氧化应激产物浓度（MDA含量）及抗氧化酶活性（SOD、GSH-px活力），以及细胞凋亡因子细胞色素C（Cytochrome c,Cyt c）和Caspase-9的表达情况。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

选取耳廓反应灵敏、ABR检测听阈不超过30dB、无中耳疾病的健康白化红目豚鼠28只，雄性，体重300-350g，由重庆医科大学实验动物中心提供。适应性喂养1周后，将筛选后的28只豚鼠随机分为4组（n=7）：假辐射组(Sham)及辐射组（2w/kg、4w/kg、10w/kg）。Sham 组置于辐射箱中不开辐射源，辐射组分别置于SAR：2w/kg,4w/kg,10w/kg连续暴露72小时。实验过程中不限制豚鼠自由活动、进食及饮水，实验中所有动物均按照标准化流程饲养，并得到重庆医科大学伦理委员会的批准。

1.2 试剂

丙二醛(MDA)试剂盒(批号 20190703)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(批号：20190701)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒(批号：20190702)均由南京建成生物工程研究所提供，BCA蛋白定量检测试剂盒（批号：20190724），细胞色素C抗体（货号：GB11080），Caspase-9抗体（货号：AB52298）均由武汉赛维尔生物科技有限公司提供。

1.3 3500MHZ辐射系统的建立

辐射系统建立参照文献[13],该系统由六部分组成：辐射源（National Instrument,USRP-2900，美国），功率放大器（恒智微波，中国），喇叭天线（A-INFO，中国），自制铁皮动物辐射箱（长宽高为60、60、80厘米），内置木箱（长宽高为40、40、60厘米），计算机。暴露程序采用软件控制，辐射强度及频率稳定且符合实验要求。

1.4 实验动物的听性脑干反应（ABR）测定

造模前及造模完成取材前均行豚鼠双耳ABR阈值测试，测试仪器为诱发电位仪（INTELLEGENT HEARING，美国），测试软件为SMART EP，测试在电声屏蔽室内进行。豚鼠经腹腔注射1%戊巴比妥钠（40mg/Kg）麻醉后，记录电极置于颅顶，参考电极置于测试耳耳廓后，地极置于对侧耳耳廓后，单频单耳刺激给声，刺激声为短音，极性为交替波。检测从80dB开始，每20dB一档逐渐递减，接近阈值时，每10dB、5dB递减，引出反应阈。阈值的判定标准为能获得可重复Ⅲ波的最小声强度。

1.5 旷场实验检测

在造模完成时，ABR检测前行旷场实验。实验方法参照文献[14],实验装置为一个四周及底壁均为黑色的有机塑料盒子（100×100×50cm），底壁等分为9个方格。实验在安静、昏暗灯光下的房间内进行，使用动物行为自动跟踪系统（ZH旷场实验视频分析系统，中国）记录并分析豚鼠在旷场内15分钟的总行程、中央格停留时间、平均速度。检查时每只豚鼠置于中央格内。为了消除异味，在每次测试之间用70%酒精彻底清洁消毒。

1.6 听皮层MDA及SOD、GSH-px检测

每组随机取4只豚鼠予以1%戊巴比妥钠麻醉后断头处死，并立即于冰上开颅，快速取出双侧听皮层组织，并用4℃的生理盐水漂洗后拭干。精密天平准确称重，用听皮层组织质量9倍的0.9%生理盐水一起研磨（在冰上进行），随后3000RPM离心10分钟取上清液，使用BCA蛋白定量检测试剂盒检测听皮层组织的总蛋白浓度，置于负80℃冰箱保存。采用硫代巴比妥酸法，在波长532nm测其吸光度，计算出组织中MDA含量；采用黄嘌呤氧化酶法，在波长550nm测其吸光度，计算出组织中SOD活力；采用比色法，在波长412nm测其吸光度，计算出组织中GSH-px活力。

1.7 细胞色素C和Caspase-9免疫荧光检测

每组取3只豚鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉后，经心脏灌注，先用0.9%生理盐水冲尽血液后，立即用4%多聚甲醛继续灌注，待头颈完全僵硬后迅速断头，切取包含听皮层部分的脑组织，置于4%多聚甲醛中固定过夜。然后包埋、切片，将听皮层组织按照免疫荧光操作技术操作，使用荧光共聚焦显微镜观察染色情况，并拍照记录。

1.8 统计分析

采用SPSS23.0软件处理所有数据，ABR采用配对样本t检验，其余数据均采用单因素方差分析。P＜0.05为统计学有差异。计量资料数据以均数±标准差（）进行描述。

2 结果

2.1 ABR

辐射前后ABR阈值检测，提示各组豚鼠(Sham,2w/kg,4w/kg,10w/kg)在不同辐射强度下的听阈均没有明显改变（t=-0.563,P=0.583,P＞0.05;t=-0.563,P=0.583,P＞0.05;t=-1.883,P=0.082,P＞0.05;t=-1.883,P=0.082,P＞0.05）（图1）。

图1 ABR听阈的变化(n=7)Fig.1 Changes of ABR hearing thresholds(n=7)

2.2 旷场实验

与sham组相比，各实验组豚鼠的运动总行程（F=0.465,P=0.709,P＞0.05）、平均速度（F=0.458,P=0.714,P＞0.05）、中央格停留时间（F=1.465,P=0.249,P＞0.05）差异均无统计学意义（图2）。

图2 3500MHz EMR对焦虑行为的影响。A：总路程（m）；B：平均速度（cm/s）；C：中央格停留时间（S）；(n=7)Fig.2 Effects of 3500MHz EMR on anxiety-like behaviors.A:the distance covered(m)B:average speed(cm/s)C:inner zone time(s);(n=7)

2.3 MDA含量及SOD、GSH-px活力

与sham组相比，MDA含量在各辐射组（2w/kg、4w/kg、10w/kg）中明显升高，差异有统计学意义（F=9.378,P=0.002,P＜0.05）。与sham组相比，SOD活力及GSH-px活性在2w/kg、4w/kg、10w/kg组中均明显降低，差异均有统计学意义（F=5.019,P=0.018,P＜0.05;F=7.142,P=0.005,P＜0.05）；且随着SAR值增大，MDA含量呈逐渐上升趋势，而SOD、GSH-Px活力呈逐渐下降趋势（表1）。

表1 3500MHz EMR对豚鼠听皮层组织MDA含量及SOD、GSH-px活性的影响Table 1Effects of 3500MHz EMR on the content of MDA and the activities of SOD、GSH-px in auditory cortex

2.4 免疫荧光

与sham组相比，各实验组细胞胞浆内呈现强烈的红色荧光信号，提示Cyt C从线粒体释放入细胞胞浆内。听皮层在EMR辐射72小时后，2w/kg组（图3B）、4w/kg组（图3C）、10w/kg组（图3D）Cyt C的表达出现逐渐增加的趋势；而Sham组荧光信号微弱（图3A）。图4显示各辐射组细胞胞浆内Caspase-9红色免疫荧光信号较假辐射组明显升高，且Caspase-9荧光信号随着SAR值增加而增强，以10w/kg组最显著（图4D）。

图3 免疫荧光检测细胞色素C的释放（×400）。A：假辐射组：呈现微弱的红色荧光信号；B：2w/kg组，C：4w/kg组，D：10w/kg组；B、C、D各组呈现逐渐增强的红色荧光信号，以10w/kg最明显。Fig.3 The release of Cyt c detected by IF（×400）.A:Sham group,very slight Cyt C positive cells were observed in sham group;B:2w/kg group,C:4w/kg group,D 10w/kg:increase of Cyt C was observed at 2w/kg、4w/kg、10w/kg groups,it reached the highest level at 10w/kg after exposure to EMR.

图4 免疫荧光检测Caspase-9的表达（×400）。A：假辐射组：呈现微弱的红色荧光信号；B：2W/kg组，C：4W/kg组，D：10W/kg组；B、C、D各组呈现逐渐增强的红色荧光信号，以10w/kg最明显。Fig.4 The expression of caspase 9 detected by IF（×400）.A:Sham group,very slight caspase-9 positive cells were observed in sham group;B:2w/kg group,C:4w/kg group,D10w/kg:increase of caspase-9 was observed at 2w/kg、4w/kg、10w/kg groups,it reached the highest level after 10w/kg exposure to EMR

3 讨论

手机是现代社会交流传递信息的不可缺少的工具，双耳和大脑是手机EMR的主要靶器官，对人体的影响是近年来研究的热点，尤其是听觉系统的影响一直存在争议。在公众人群中，Oktay[15]对40名使用手机超过4年、使用时长不同的健康成人行ABR检查，发现10-20min/天的手机使用人群ABR阈值无明显改变，但2h/天的手机使用人群ABR阈值升高；Gupta[16]对67名使用手机超过1年的成人行ABR检查，未见明显异常。在特殊人群中，Oktay[17]发现长期职业暴露于EMR可提高ABR阈值。然而我们前期研究发现SD大鼠急性（48h）或慢性（1h/天，连续48天）暴露于1800MHz（4G），ABR阈值均没有明显改变；但Maskey[18]研究发现小鼠间断暴露于EMR3个月可升高ABR阈值。本次研究结果显示，实验组在2、4、10w/kg辐射强度下，ABR反应阈值均无明显升高（P＞0.05），表明短期暴露于3500MHz（5G）EMR，即使在10w/kg（职业暴露）的辐射强度下，ABR阈值无显著改变，考虑是由于本实验是以ABR作为评估听觉改变的功能性指标，豚鼠的ABR波形反映的是从耳蜗听神经到外侧丘系或下丘的功能状态，但并不能反映听皮层的功能状态，因此，听皮层的病变不能引起ABR波形的改变，本课题组拟进一步探讨暴露于EMR后听皮层的听觉诱发电位情况。

活性氧簇（Reactive oxygen species,ROS）是生物体内一系列具有高度活性的氧自由基的统称。ROS系统的激活是手机EMR产生生物学效应的主要机制[13,19]，过量的ROS可导致氧化损伤作用。氧化损伤是指机体内的氧自由基的产生与清除之间出现严重失衡时,氧自由基对细胞及组织的一系列损害作用。丙二醛（MDA）是氧自由基参与脂质过氧化的重要产物，它能够引起机体内蛋白质等生物大分子的交联聚合及酶丧失活性,其含量的高低可直接反映组织细胞受氧化损伤的程度。SOD及GSH-px是主要的抗氧化系统，SOD能清除机体内部多余的自由基，有效阻止氧自由基造成的损伤，并具有修复损伤细胞的功能。GSH-px可结合氧自由基及过氧化物，参与体内氧化还原反应，在细胞抗氧化过程中起重要作用，其降低后可增加ROS的生成，促进细胞凋亡。MDA、SOD和GSH-px是评价氧化损伤和抗氧化能力的重要指标。在体外研究中，Xu[20]发现暴露于1800MHz EMR可引起原代皮层神经元线粒体DNA损伤，并导致活性氧（ROS）含量增加；在动物实验中，Alkis[21]发现暴露于900MHz、1800MHz、2100MHz EMR 6个月可引起大鼠脑组织的DNA损伤，MDA及8-hydroxydeoxyguanosine(8-OHdG)生 成 增 加 ；Esmekaya[22]发 现900MHz EMR导致大鼠心脏、睾丸、肺、肝脏组织的氧化应激损伤，表现为MDA、NO生成增加，GSH-px活性降低。以往的文献都倾向于研究不同频率及强度的EMR对海马、耳蜗、肝脏、生殖系统等的影响，我们的实验首次研究3500MHz EMR对听皮层的影响。与上述研究结果一致，本实验结果显示，与sham组相比，各辐射组听皮层组织MDA含量均明显增加，而SOD、GSH-px活力均显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）,且随着SAR值增大，豚鼠听皮层组织MDA含量呈上升趋势，而SOD、GSHPx活力呈下降趋势。表明在各辐射组中ROS的清除能力下降，并随着辐射强度的增加而愈加明显，导致听皮层组织细胞损伤，即便在2w/kg辐射强度下，3500MHz（5G）手机急性电磁辐射亦能诱发听皮层氧化应激损伤。

线粒体是氧化应激的主要部位，Cyt C是线粒体中的一个细胞凋亡因子，在呼吸链电子传递和细胞凋亡中起着重要作用，线粒体Cyt C可通过对凋亡信号的传导和放大来调控细胞凋亡。Cyt C在正常情况下定位于线粒体膜，在诱导因素的刺激下释放至胞浆。Caspase家族是一高度保守的半胱氨酸蛋白酶家族，其启动蛋白酶级联反应，对凋亡的起始和执行起着重要作用。据报道，手机电磁辐射可上调神经元和星形胶质细胞的凋亡通路[23]；也有报道表明暴露于2450MHz电磁辐射下28天，可导致海马组织线粒体功能紊乱及细胞色素C的释放从而激活细胞凋亡的内在途径[24]。在本实验中，各暴露组听皮层的Cyt C在胞浆中表达，且随着SAR值增高，表达逐渐增强。释放入胞浆中的Cyt C可结合凋亡蛋白激活因子-1（Apaf-1），Apaf-1与Caspase-9结合后形成凋亡复合体，再裂解并激活下游的Caspase，从而诱导凋亡。而活化的Caspase-9也可促进线粒体释放Cyt C，形成正反馈环路，促进更大规模Caspase激活和细胞凋亡。

氧化应激一直是包括焦虑在内的精神和神经疾病的研究焦点。Rammal[25]和Bouayed[26]在焦虑小鼠的外周血和大脑神经元细胞中均检测到ROS的累积，且氧化应激水平与焦虑程度呈正相关。越来越多的证据也表明，线粒体的功能与焦虑存在双向联系，线粒体功能的改变可能导致焦虑；相反，在焦虑人群中可检测到线粒体功能的改变[27]。ROS系统的激活是手机EMR产生生物学效应的主要机制，因此我们进行了旷场实验。旷场实验常用于评价动物的活动量及焦虑情绪，它的设计原理基于龋齿类动物的趋避性，即此类动物在未知的新环境中表现出的贴墙活动的特征[14]。有研究报道，将大鼠暴露于EMR（900MHz，4h/天）持续15天可增加大鼠的焦虑水平[28]；而另一组研究发现，将大鼠暴露于EMR（900MHz,2h/天，5天/周）持续5周，大鼠未表现出明显的焦虑行为[29]。我们的实验结果和后者一致。在本次实验中，各辐射组和sham组中豚鼠的活动总路程、中心区域停留时间和平均速度均无统计学差异，表明我们的电磁辐射模式没有增加豚鼠的焦虑行为，这可能是因为线粒体氧化应激损伤和凋亡仅仅是引起焦虑行为的一部分诱因，线粒体的能量代谢、钙离子浓度、神经类固醇激素的变化等都对焦虑行为产生重要影响。此外，焦虑行为是由一个包括大脑皮层、海马、杏仁、脑干等多个区域的脑回路共同调节管理[27]。不同的物种和EMR暴露参数也会对焦虑行为产生影响。我们拟进一步研究电磁辐射对豚鼠焦虑行为的作用机制。

根据国际非电离辐射委员会（ICNIRP）相关规定，美国、欧洲和国内标准手机SAR值设置上限通常是2w/kg，但手机在接通瞬间和通话过程中，脑组织吸收电磁能量可以达到4w/kg,职业暴露时达到了10w/kg[7,30]。本研究的初期，我们的研究模型是一个72h急性暴露模型。当然，这样的频率和使用时间并不常见，但这种过度暴露可能在职业暴露和一些特殊的紧急情况下成为现实。

综上所述，本实验首次研究了3500MHz（5G）手机急性电磁辐射对豚鼠焦虑行为及听皮层的影响，并得出如下结论：氧化应激损伤是3500MHz（5G）手机急性电磁辐射产生生物学效应的重要机制，损伤的氧化应激系统可诱导线粒体细胞色素C的释放，进而活化Caspase-9诱导细胞凋亡，且随着SAR值增大，听皮层损伤加重。然而，实验发现动物模型听阈和旷场实验指标无明显变化，考虑与辐射时间、辐射强度等有关，本课题组拟进一步通过延长暴露时间来验证手机电磁辐射的长期累积效应。