根瘤菌多样性研究技术进展

马莲菊, 朱 淼, 汪雅楠, 朱梦卓, 赵晓妍, 董芮萌, 王 泽

(沈阳师范大学 生命科学学院, 沈阳 110034)

0 引 言

根瘤菌属于革兰氏阴性菌,呈杆状或球状,与特定宿主植物结瘤形成共生固氮体系[1]。共生固氮体系的形成由多方面因素共同调节,植物在根瘤菌刺激下产生类黄酮物质激活结瘤基因nod,根瘤菌内部会产生根瘤菌粘附素(rhicadhesin)以及胞外多糖等物质,在这一系列物质共同作用下使其附着于根部[2]。根瘤菌借助于植物的根毛尖端位置进入宿主植物的皮层,在皮层处进行大量繁殖。皮层细胞则由于根瘤菌的分泌物刺激而快速分裂,最后根瘤菌被包裹于该皮层细胞中央,二者结合形成根瘤。豆科植物为根瘤菌提供水、有机物和矿物质等,根瘤菌则帮助豆科植物将空气中游离的氮还原为铵态氮,为植物提供氮源,同时使土壤肥力得到提升[3]。

根瘤菌在农业、环境和生态等方面起着可持续发展的作用[4]。根瘤菌多样性是指不同根瘤菌在生理结构、生化特征和基因结构等方面表现的特异性差异。根瘤菌在长期进化过程中不仅受宿主的选择,而且也受环境因素影响,因而根瘤菌不断地朝着多个方向演变和进化,致使其生物多样性丰富[5]。目前,在生物固氮研究领域内,根瘤菌多样性研究是一个热点,研究技术体现出多学科的交叉、渗透与综合[6]。系统发育是现代根瘤菌分类系统得以建立的一个重要基础,通过对根瘤菌系统发育开展进一步的分析,能够把握根瘤菌与其他相关菌种之间的联系,同时也能分析根瘤菌演变的历程,进而可以确定根瘤菌在系统中的地位。本文对根瘤菌表型多样性和遗传型多样性的研究技术进行综述,以期为根瘤菌的系统分类提供理论依据。

1 表型多样性

根瘤菌的表型分群是指在根瘤菌的形态特征、血清学反应及其生理功能等方面,利用数值分类[7]、全细胞可溶性蛋白电泳[8]、多位点酶电泳[9]和细胞脂肪酸组成分析[10]等技术进行初步分群,揭示根瘤菌的生物多样性。

1.1 数值分类

数值分类法是细菌分类中常用的一种方法,主要是借助计算机系统对所需要分类的细菌或根瘤菌表型性状的相似程度进行数值分析归类。数值分类结果与传统方法分类结果一致,但与传统方法相比具有一定优点。通过借助计算机对表型特征数据进行比较,计算机的分析可以在一定程度上有效避免人为主观性对结果造成的影响[11]。另外,实验过程经过对表型系统分析可得到聚类分析图谱,能够准确揭示表型一致或差异的根瘤菌菌株,此过程以相似性80%作为种群划分标准[12]。

数值分类通常被用在根瘤菌多样性和分类的初步研究中,谷峻等[13]通过采用表型数值分类等方法,对20株甘草根瘤菌在碳、氮源以及生理生化性状等方面进行测定分析,结果表明,与甘草共生的根瘤菌分为3个菌属,具有丰富表型多样性。刘洋等[14]主要对30株岩黄芪根瘤菌不同方面进行研究,从营养利用、抗生素抗性到抗逆性等方面分析结果进行数值分类,得出不同地域或不同宿主的根瘤菌都具有丰富表型多样性的结论。韦革宏等[15]也通过采用数值分类的方法,在唯一碳、氮源的利用等方面对40株菌株进行测定,同样证实了供试菌株具有表型多样性。

1.2 全细胞可溶性蛋白电泳

全细胞可溶性蛋白电泳,即SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,是应用于细胞表型多样性研究的重要基础。该电泳技术既能够准确地分析各种可溶性蛋白的组成成分,又能够对生物蛋白质图谱的信息进行分析和研究。根瘤菌的蛋白质结构复杂,多态性信息量大,利用全细胞可溶性蛋白电泳技术研究根瘤菌,从蛋白质电泳图谱上表现出来的多态性能够反映出根瘤菌的多样性[16]。随着技术的发展,凝胶扫描以及分析软件的出现与普及,SDS-PAGE在原本基础上变得更加快速、简便且重复性好。近年来,SDS-PAGE技术被用于菌种相互之间与种内差异的分析与研究[17]。汪恩涛等[18]运用凝胶电泳技术,对40余种根瘤菌菌株的可溶性蛋白进行分析测定,结果证明此方法可用来分析根瘤菌表型多样性。闫爱民等[19]对干旱地区根瘤菌菌株进行电泳分析,结果证明蛋白分析的聚类结果与数值分类结果相近。刘晓云等[20]也采用了SDS-PAGE分子标记法,对筛选的120株根瘤菌进行初步分群得到 104个类型。

1.3 多位点酶电泳

多位点酶主要是指不同位点上的基因序列所编码的具有相同作用的酶。通过多位点酶电泳技术(MLEE)对根瘤菌多样性进行分析是利用酶的特异性的原理对酶进行分离,即不同种类的酶与特异性底物反映显示不同颜色,最后对电泳的迁移率进行比较,得到酶谱推理根瘤菌多样性[21]。利用多位点酶电泳技术分析菌落多样性在根瘤菌表型多样性分析中具有重要地位。在根瘤菌分类与表型多样性研究中,多位点酶电泳技术已被证明是初步分群的有效办法。王素英等[22]对黄芪根瘤菌,许晓东等[23]对天山根瘤菌利用多位点酶电泳技术进行研究分析,结果表明,多位点酶电泳图谱聚类分析结果与数值分类的结果基本一致,可以作为根瘤菌分群手段。李颖[24]对宁夏沙坡头地区的17种根瘤菌进行多位点酶电泳分析,结果表明异柠檬酸脱氢酶、超氧化物歧化酶等酶谱更有利于区分不同根瘤菌种群。

1.4 细胞脂肪酸组成与脂多糖分析

脂肪酸是酯类和其他脂多糖的重要构成部分,在细胞膜上广泛存在。不同种属细菌对应的脂肪酸碳链的取代基团、双键位置和长度等方面存在较大差异。微生物学研究表明,细菌的DNA与细胞结构中常见的脂肪酸具有高度的同源性,不同类型的细菌含有的脂肪酸在含量或组成成分上存在差异,且差异具有稳定性。因此,建立具有不同种类细菌独特特征的细胞脂肪酸指纹图谱,可得到目的菌株的表型多样性[25]。根瘤菌的脂多糖结构和根瘤菌豆科植物共生固氮体的形成有着密切关系。与细胞脂肪酸同理,对于不同种类根瘤菌,通过脂多糖分析可将糖的排列方式与种类的差异反映出来[26]。

目前,脂肪酸分析各部分技术均可高度自动化。张小平等[27]对分离自花生的22种根瘤菌的细胞脂肪酸组成进行测定,结果显示花生根瘤菌的进化方向与大豆根瘤菌一致,说明细胞脂肪酸组成分析法结果具有可信性。程涛等[28]采用全细胞脂肪酸组分分析法,对分离自木本豆科植物的根瘤菌进行鉴定,结果发现所测的2株根瘤菌为根瘤菌属中的新种。卜常松等[29]通过气相色谱分析大豆根瘤菌的细胞脂肪酸,最终将供试菌株分为6种不同菌株。

2 遗传型多样性

表型特征能够综合反映出根瘤菌表型多样性,但无法将根瘤菌的全部遗传信息反映出来。有研究表明,在表型多样性分析中即使将待测菌株的指标增加至300项,经过聚类分析得到的结果也只能反映该生物的5%～20%的遗传信息[30]。遗传信息主要储存在核酸内,通过对核酸信息变化进行分析,可以揭示根瘤菌间亲缘关系。因此,选择基因序列或一些特定基因片段进行检测已成为建立根瘤菌系统发育系统的常规手段[31]。

2.1 基因组水平指纹图谱

基因组水平指纹图谱分析是指在基因组水平上检测并分析基因的多态性。不同的生物个体或不同种群在基因上存在差异,利用基因组水平指纹图谱分析可以对其进行分类。基因组水平研究的主要手段有基因组物理结构分析、随机扩增DNA片段的多态性分析、AFLP指纹分析技术、rep-PCR指纹分析技术和稳定小分子RNA图谱等。

1) 基因组物理结构分析是通过对细菌全基因组DNA序列进行分析,得到目的菌株全部遗传信息,是目前研究系统发育最为准确的方法,但对于大量待测菌株而言,耗资巨大。郑君芳等[32]利用Ⅰ-CeuⅠDNA内切酶对64株根瘤菌总DNA进行酶切,通过基因组物理结构分析明确了根瘤菌系统的发育关系。

2) 随机扩增多态性DNA标记技术(RAPD) 是通过对PCR产物开展分析,同时借助生物性状表现规律和基因排列间的相互关联完成一系列预测。该项技术需要选用寡核酸片段来作为引物,一般为8～10 bp核苷酸片段,利用PAGE电泳技术开展DNA多样性的检测[33]。陈丽云等[34]通过RAPD技术对分离自苜蓿和草木樨的根瘤菌进行分析,结果表明17株菌株分别来自6个不同菌系。隋新华等[35]利用RAPD等方法对分离自我国北方山黎豆属和棘豆属的植物根瘤菌进行研究,结果表明山黎豆属植物主要与根瘤菌属结瘤,而棘豆属植物主要与中华根瘤菌属结瘤。杨成运等[36]通过RAPD等方法对分离自我国亚热带地区42株豌豆根瘤菌进行研究,结果表明这些供试菌株具有明显的地域特征。

3) AFLP指纹分析技术[37],即对扩增片段长度多态性进行分析。随着仪器设备的更新,AFLP技术结合荧光标记技术称为FAFLP技术。FAFLP技术使多态性分析技术反应可在测序仪器上进行,数据更加标准,也使AFLP指纹图谱相互比较更加方便[38]。建立AFLP指纹图谱信息数据库,便于AFLP比较,增加信息稳定性和可靠性[39]。陈强等[40]运用AFLP等技术对四川省23株葛藤属根瘤菌进行遗传特性研究,经过分析显示,此批菌株分为7个遗传群。贾腾飞等[41]在已建立的AFLP体系下,结合地理生物学因素,对青海省不同地区的蚕豆根瘤菌进行遗传特性研究,结果可将这些根瘤菌分为2个AFLP遗传群,2个主群又分为4个亚群。徐开未等[42]应用RFLP,AFLP等技术对凉山州新银合欢中分离的33株根瘤菌进行遗传特性研究,结果表明,这些根瘤菌有丰富的多样性,可分为4个菌属。

4) rep-PCR指纹分析技术是指对根瘤菌基因组重复序列进行PCR的技术。根瘤菌基因组中分布较为广泛的短基因序列有REP[43], ERIC[44]和BOX[45],这些短基因序列都存在于根瘤菌基因组中,碱基小于200 bp且含有多个拷贝。Mosbah等[46]运用rep-PCR技术对沙特阿拉伯西南部5种植物中分离得到的75株根瘤菌进行遗传多样性鉴定,结果表明可将其分为4个已知的结核杆菌属,具有良好多样性。孟颂东等[47]和李俊等[48]应用rep-PCR技术对新疆大豆根瘤菌和中国花生根瘤菌进行指纹分析,结果表明来自同一地区根瘤菌具有较高遗传相似性,不同地区根瘤菌间有丰富的遗传多样性。

5) 稳定小分子(LWMRNAS)RNA图谱包括5S rRNA和tRNA,该技术在微生物分类鉴定方面具有很大的潜力[49]。稳定小分子RNA有稳定且能反映种属差异的特点,常被应用于根瘤菌的分类研究中[49]。杨帆等[51]对稳定小分子量RNA指纹图谱技术的原理和发展历程进行综述,同时对该技术在根瘤菌分类研究中的应用现状和前景进行了阐述。

2.2 特殊基因扩增片段酶切图谱分析

根瘤菌属于原核生物,rRNA包括5S, 16S和23S 3种。5S rRNA片段小,能够携带的遗传信息少,不能体现微生物多样性;16S rRNA, 23S rRNA, 16S-23S rRNA基因间隔区序列(IGS)等序列携带遗传信息可以体现遗传多样性,因此可选择16S rRNA, 23S rRNA, IGS序列的特异性片段、限制性片段进行研究[52]。特异性片段多态性分析(ARDRA)技术常被用于根瘤菌种、属水平的分群和系统分类研究中[53]。李彪等[54]对在兰坪铅锌尾矿区豆科植物分离的49株根瘤菌进行ARDRA分析,结果表明这些根瘤菌在系统发育树中分别属于3个系统发育分支,进一步说明其具有良好的遗传多样性。

16S rRNA序列是最早被用于根瘤菌分类揭示根瘤菌系统发育的保守基因[55],16S rRNA全序列的测定在细菌分类中占有不可或缺的地位[56]。研究发现种间有16S rRNA基因片段相互转移的现象,即16S rRNA核苷酸序列中包含了不同来源的16S rRNA序列[57-58],这些研究结果表明如果仅依据根瘤菌的16S rRNA建立系统发育体系,确定菌株多样性较为片面,确定菌株种属应建立在多个基因序列分析乃至全基因组序列分析的基础上。

随着基因组测序技术的发展与完善,有专家学者在研究根瘤菌系统发育时会选择23S rRNA基因序列分析。Van等[59]通过对rrn操纵子内3个位点的测序分析,比较一组具有代表性的α-变形杆菌之间的进化关系,得出23S rRNA与16S rRNA序列分析的结果有很大差异性。23S rRNA核苷酸序列有种间或菌株间特异性和高度变异区,针对这一特性可以利用原位杂交探针鉴定根瘤菌遗传型多样性,该技术在根瘤菌遗传多样性研究中具有重要地位。潘峰等[60]采用16S-23S rRNA基因区间(intergenic spacer region, ISP)的PCR-RFLP对饭豆根瘤菌进行了遗传型多样性和系统发育分析,发现所有菌株最终形成了慢生型菌群与快生型菌群两大菌群。高俊莲等[61]选取40株未知斜茎黄芪根瘤菌与14株已知根瘤菌,通过23S rRNA PCR-RFLP比较分析,结果发现其具有良好的遗传多样性且与聚类分析树状图谱有较好的一致性。

3 展 望

根瘤菌作为一种高效的自然微生物资源,其开发利用越来越引起人们的关注。近年来,根瘤菌多样性研究技术取得了长足的发展,从早期利用数值分类和SDS-PAGE等方式研究表型多样性,到目前利用根瘤菌基因序列研究遗传多样性,这样既有助于人们对根瘤菌多样性以及系统发育的深入研究,也提高了研究结果的准确性。在系统发育研究中,多技术的综合应用可提高实验数据的准确性,对根瘤菌系统发育研究有着重要意义。

豆科植物除了有共生固氮改善土壤养分的作用,还可以起到保护水土、防风固沙和改善土壤环境等重要作用,而这些作用都离不开根瘤菌。我国豆科植物资源非常丰富,遍布于温带、亚热带等多个地区,根瘤菌来源丰富。大力开发不同环境条件下、不同宿主植物中根瘤菌,以及分离筛选出人们能够加以利用的优势菌种具有重要意义。目前,根瘤菌资源的开发利用率还较低,只有较少一部分的根瘤菌被制作菌剂,用于农业生产、环境改善和科学研究等方面。因此,现阶段主要任务除了对已开发的菌种资源进行有效的保护和深入研究外,还应继续对自然界中新分离筛选的根瘤菌进行种属分类,进一步丰富扩大根瘤菌菌种资源库。