干细胞的研究进展和应用前景

王 泽, 宋 扬, 秦林伟

(沈阳师范大学 生命科学学院, 沈阳 110034)

干细胞(stem cell,SC)是指在一定条件下具有无限自我更新增殖和限制性分化能力的一类细胞,它们能产生表现型和基因型与自己完全相同的子细胞,也能分化为某种特化细胞或祖细胞。按照来源可以分为胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)和成体干细胞(adult stem cell),按照分化潜能可分为全能干细胞(totipotent stem cell)、多能干细胞(pluripotent stem cell)和单能干细胞(monopotent stem cell)。ESC是典型的全能干细胞,有形成完整个体的分化潜能;间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)和诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,IPSC)为多能干细胞,具有产生多种类型细胞的能力,但是无法发育成完整的个体。3种干细胞在细胞移植、再生医学、组织工程、毒性评价、神经退行性疾病治疗等领域的应用价值日益凸显,并有望在疾病治疗中替代传统的药物治疗,已经成为干细胞应用领域的研究热点。

1 胚胎干细胞的研究与应用

1.1 胚胎干细胞的建系

胚胎干细胞是源于早期胚胎或原始性腺的一类全能性干细胞,具有典型的特征性表面标志物如糖脂类SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4及蛋白多糖类TRA-1-60, TRA-1-81, GCTM2等,是ES建系鉴定、质量评价及污染判定的标准。传统的ESC培养多采用以骨髓间充质干细胞、毛囊间充质干细胞、小鼠胚胎成纤维细胞等为主的有饲养层培养体系,目前,ES的无血清无饲养层培养体系[1]、无动物源性培养体系[2]、悬浮培养体系[3]等培养模式得到了广泛的探讨。ESC建系多来自动物的桑椹胚、囊胚等胚胎组织,常用的分离方法有免疫外科法、机械分离法、酶消化法和单卵裂球法等。1981年首次成功分离获得小鼠ES细胞,1988年Thomson等在建立灵长类动物恒河猴ES细胞系的基础上,成功建立人的ES细胞系。目前,已分离获得了仓鼠、大鼠、兔、猪、牛、绵羊、山羊、水貂、恒河猴、美洲长尾猴等ES细胞。此外,Kim[4]通过激活小鼠卵母细胞的方法,分离得到了与受体免疫系统组织相容的胚胎干细胞系。刘佳等[5]利用孤雌激活的小鼠囊胚建立了2种形态和生物学特征极其接近ES的细胞系Pa-AFSCs和Ja-ASCs,极大地推进了胚胎干细胞的医疗应用进程。

1.2 胚胎干细胞的诱导分化

理论上,ESC可以被诱导分化为3个胚层的所有细胞类型。目前,人ESCs(hESCs)可以人工诱导分化为滋养层细胞、神经细胞、神经胶质细胞、造血细胞、心肌细胞等。由于ESCs在能量代谢、物质代谢和大分子合成方面具有独特的生理特征,ESCs的生长、自我更新和分化谱系等受到其培养环境、细胞因子、营养物质等因素的影响显著,如高水平的蛋氨酸代谢对于小鼠胚胎干细胞(mESCs)维持自我更新和多能性至关重要,蛋氨酸代谢水平降低可以促进mESCs向3个胚层分化[6];体外培养基中加入BMP4, Activin A, BGFG和VEGF可以定向诱导mESCs向造血细胞和血管内皮细胞分化[7];单独增加Activin A能够显著促进hESCs向神经外胚层细胞的分化。Park等[8]发现MAGEA2下调会引起mESCs发生多能性标志基因表达的降低、S期细胞周期阻滞、caspase依赖的凋亡等生物学事件。利用shRNA抑制mESCs多梳家族蛋白PHC1的活性,可以上调mESCs定向分化为心肌细胞的分化效率[9]。mESC-PA6共培养的条件培养液可以显著增强mESCs的神经分化[10]。ESCs的定向诱导研究对于了解ESC的多能性、自我更新和系统分化等生物学过程和分子机制具有重要的科学价值。

1.3 胚胎干细胞的应用

胚胎干细胞现已成为研究早期胚胎发育途径、疾病预防和药物毒性的有力工具。临床级别的hESC细胞系Q-CTS-hESC-2在非xeno条件下可分化成视网膜色素上皮细胞,在湿性黄斑的损伤区域可检测到rpe样细胞层的存在[11]。hESCs经过定向诱导可分化为更接近髁突软骨的细胞[12],为实现髁突软骨的原位修复提供了一种更合适的和更有前景的工具细胞。使用CRISPR/Cas9n技术删除临床级hESC细胞系中内源性SNCA基因,可以降低病患者脑内路易体的发生率[13],为治疗帕金森氏病(PD)提供了一种新的细胞替代治疗策略。事实上,相对于其他干细胞,由于胚胎干细胞的分离和纯化较为繁琐、定向分化的机制尚不明朗等风险因素较难在临床中大规模应用,但是单倍体胚胎干细胞已经在基因组印记、遗传筛选、基因突变细胞文库构建等方面得到了广泛的应用。

2 间充质干细胞的研究与应用

2.1 间充质干细胞的建系

间充质干细胞,又称多潜能基质细胞,是源于中胚层和外胚层的多能干细胞,可以从结缔组织或器官间质分离获得,研究显示,使用基质胶消化法得到的ADMSCs成脂、成骨分化潜力优于直接消化法。DMEM/F12培养基、MEM培养基等是MSCs体外培养的常用培养基,培养体系中最适宜的锌离子浓度为10-7mol/L,过高过低均损害骨髓间充质干细胞的增殖能力。程明等[14]利用质粒和脂质体共转染,得到稳定表达TERT基因的崂山奶山羊BMSCs。目前,研究人员相继建立了兔子、猪、鼠、牛、人等物种的间充质干细胞系,为相关物种的繁育、种质基因库研究奠定了基础。

2.2 间充质干细胞的诱导分化

相对于其他成体干细胞,MSCs具有强大的增殖能力和多分化潜能,目前,MSCs可被诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、神经细胞、肝细胞、内皮细胞、基质细胞等多种细胞,同时,国际细胞治疗协会(ISCT)确定体外可诱导为脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞的能力为MSCs鉴定的必检指标。MSCs的分化能力和分化方向受到信号通路、培养体系、关联基因等因素的调节。徐弘远等[15]提出微环境可通过改变细胞骨架形状、架构等因素影响间充质干细胞分化趋向。贺继刚等[16]研究发现:miRNA-673-5p通过抑制TSC-1蛋白的表达进而促进BMSCs向心肌样细胞分化,BMSCs的成骨分化受到多基因的调节,如RAI3基因敲除可促进BMSCs的体外和体内成骨[17],过量表达Lgr5的BMSC表现出更强的成骨能力,抑制Lgr5表达会降低BM-MSC的成骨分化能力[18]。这为BMSC在骨再生中的应用开辟了广泛的研究模型。

2.3 间充质干细胞的应用

MSCs因其突出的抗氧化活性、免疫重构等特性,是临床研究和应用最为深入的干细胞。其中,美国批准了60余项间充质干细胞的临床试验,已成为阿尔茨海默病、渐冻症等疾病的新兴治疗方案。脑室内注射的BMSCs可以通过改善星形细胞炎症和诱导突触发生,修复AD模型小鼠的认知障碍[19],BMSCs移植可以通过抑制T细胞的增殖和活化,减少炎症细胞因子的产生,阻止实验性自身免疫性脑脊髓炎的发展;通过增强胞葬作用,促进心肌I/R大鼠心肌炎症的消退[20]。刘广洋等[21]研究发现MSCs可以通过抑制肺部浸润的免疫细胞减轻急慢性肺损伤。脂肪间充质干细胞(AMSCs)因其来源方便的特点,被广泛应用于急性心肌梗死治疗、急性肝脏衰竭、脑损伤记忆障碍、造血调控等方面的探讨研究。AMSCs鞘内移植可以改善脊髓栓系综合征大鼠后肢运动能力,有效促进其损伤神经的修复[22],AMSCs大鼠左侧海马CA3区移植可以增强癫痫大鼠血清及海马组织中的自由基清除能力,有效改善机体的氧化应激效应。外泌体是间充质干细胞旁分泌的重要组成部分,源于hMSCs的外泌体能够抑制成纤维细胞样滑膜细胞系的增殖和迁移,促进其凋亡,为类风湿关节炎的治疗提供新的治疗策略[23]。富含miR-17-92簇的mMSCs外泌体可以被大鼠周围神经末梢摄取,并逆行运输到前角的DRG神经元和脊髓运动神经元,大大增加了中风大鼠神经可塑性、神经发生和功能恢复[24]。小鼠脑损注射hADSC-ex后,优先被小胶质细胞/巨噬细胞摄取,并通过NF-κB和p38-MAPK信号通路减轻神经炎症反应,从而改善大鼠创伤性脑损伤微环境,促进感觉运动神经的再生和功能的恢复[25]。外泌体为间充质干细胞在组织损伤修复、抗炎治疗、神经系统疾病、药物运载体研发等领域的应用提供了新的视角。

3 诱导多能干细胞的研究与应用

3.1 诱导多能干细胞的建系

诱导多能干细胞是通过导入特定的转录因子将终末分化的体细胞重新编程逆转为多能性干细胞。2006年日本京都大学Shinya Yamanaka利用病毒载体将转录因子Oct4, c-Myc, Kif4, Sox2导入小鼠成纤维细胞,获得首例iPSCs,目前,约有10个基因可以参与体细胞向iPSCs的诱导转化。iPSC性状与ESC相似,具有相同的二倍体核型、高度的自我更新能力。但是,iPSC建系完成后往往需要从细胞和组织功能水平等方面进行鉴定排查,如胚胎干细胞标志物是否表达、启动子去甲基化程度、是否致畸胎瘤等。目前,国内外构建的人iPSC系多来源于羊水细胞、尿细胞、外周血单核细胞、肾上皮细胞、成纤维细胞等。其中,尿源性细胞因为更容易获取、成本低廉、无创伤,重编程效率高,同时不受性别、年龄和身体状况等实验因素干扰的优势而广受关注。

3.2 诱导多能干细胞的分化

目前,iPSC细胞可被诱导分化为生殖细胞、心肌细胞、神经细胞、上皮细胞、破骨细胞、胰岛分泌细胞等终末分化细胞,甚至间充质多能性干细胞。Kitajima等[26]将黑猩猩成年皮肤成纤维细胞诱导为iPSCs,并重建了早期神经发育过程,为更好地理解黑猩猩及人脑神经发育的分子细胞学基础提供了有力的工具[27]。UQCRC1 p.Y314S突变的外周血单个核细胞可以诱导建立iPSCs系,并在体内向3个胚层分化[27];利用癫痫患者外周单核细胞,诱导产生了携带PIK3R2杂合突变的人iPSC细胞系,不仅能够分化为3个胚层,并表达内源性多能性标记物,使得更好地理解癫痫及其早期用药筛选成为可能[28]。营养物质不仅影响体细胞向iPSC细胞系的重编程过程,同时可以决定iPSC特定细胞系的分化形成[29]。Hepburn等[30]借助诱导性泌尿生殖窦间充质共培养技术,大大提高了iPSC体内外分化为前列腺组织的成功率。高通量测序结果显示,通过调节与TGF-β信号通路microRNAs 的表达可以促进hiPSCs向NSCs的诱导分化[31]。

3.3 诱导多能干细胞的应用

事实上,iPSC细胞系因其无伦理障碍、来源容易、免疫排斥小、强分化能力等独特优势,开启了细胞治疗、发育分化研究、疾病模型建立及药物评价的新纪元。自体皮肤成纤维细胞来源的iPSCs移植可发挥免疫调节作用,如有效缓解大鼠的急性肺损伤和减少炎症因子释放,改善小鼠肾组织损伤并对系统性红斑狼疮具有一定的治疗作用。iPSCs技术的成熟极大地推动了神经组织损伤修复和再生医学的研究进程,研究人员首次成功地将人血细胞直接重新编程成为神经板边界干细胞,这些iPSCs可以产生神经嵴和中枢神经系统谱系的功能细胞类型,并可以通过基因编辑技术建模人类疼痛综合征[32]。吴轩[33]完成了iPSCs定向分化为运动神经元及3D神经网络的构建,为神经疾病模型构建和治疗研究提供了优秀的细胞模型。此外,小鼠右侧脑室内注射的iPSCs通过归巢效应,可显著减少缺氧缺血性脑病新生小鼠神经元的丢失和修复脑损伤。研究显示,hiPSCs可以被定向诱导为人视网膜色素上皮细胞和光感受器,稳定或者恢复动物模型视力。此外,利用带有疾病基因的体细胞重编程的iPSCs,为发病机制、药物开发以及治疗方案的研究提供了更加真实的开发平台,利用CRISPR-Cas9系统建立的Peptide transporter-ko iPSCs被用于肠道药物吸收效力的研究[34],多重耐药基因1-ko iPSCs为MDR1潜在底物评估与药代动力学测试提供了良好的研究模型[35],但是,真正应用于人类治疗的iPSCs细胞来源方案和移植程序等仍然需要优化和验证。

MSCs,iPSCs和EMCs在组织损伤修复、疾病模型建立、药物评价等应用领域均具有各自明显的优势,同时也面临着诸多挑战和应用短板。在安全性方面,ESCs和MSCs的致瘤系数远大于iPSCs,ESCs的伦理道德受限、维持未分化状态时间短、遗传不稳定、诱导分化效率低等状况大大限制了其在临床上的深入应用。iPSCs技术的重要性在于其打破了干细胞研究中不可回避的伦理道德和免疫排斥等局限,为干细胞的临床应用和研究提供了一个全新的视角,但值得注意的是,截至目前,不同组织、器官来源或不同发育阶段的体细胞生成iPSCs的效率和安全性仍存在较大差别。因此,干细胞研究领域未来在某些领域仍需要突破性成果来促进其应用价值的发挥,例如: 1)阐明其增殖、分化的内部机制,以促进神经科学、心脏病学和再生医学中的疾病模型的建立与应用;2)基因组编辑工具在干细胞领域的成熟运用,以提高干细胞应用的安全性和稳定性;3)广泛利用组织工程学、3D支架技术对培养体系进行改造,提高干细胞应用的可重复性和标准化等。