骨科中的细胞力学研究进展*

郎爽，陈恒亭，马剑雄，马信龙

(天津医院中西医结合骨科研究所，天津 300211)

1 引 言

1.1 细胞力学概念

细胞力学是研究细胞在不同力学环境下的细胞膜和细胞骨架的形变、弹性常数、粘弹性、粘附力等力学参数，来探索细胞、细胞器、蛋白、核酸等构成细胞的生物大分子的力学性质，以及发生在细胞内、细胞膜、核膜内、核酸以及蛋白质中的力学现象。最终用于调节机体细胞生长、发育、成熟、增殖、衰老和凋亡的过程，描述机体的力学机制。

1.2 细胞力学的研究内容

随着科学技术的进步，研究者将科研重心转移到细胞水平，以探索细胞微观结构对细胞整体力学的影响及其作用机制[1]。细胞力学的研究涉及人体的各种细胞，细胞力学的应用推动了细胞和组织工程、心血管力学生物学、骨关节与软组织生物力学、临床医学和康复工程生物力学生物材料等方面的发展，特别是对血液循环系统、人体支撑运动系统、消化系统等相关的细胞进行了广泛研究[2]，在此主要讨论细胞力学在骨科研究中的应用。

1.3 细胞力学的结构基础

在细胞力学研究中，细胞膜是一层由带双链的类脂和蛋白质组成的脂双层膜，细胞膜薄而柔软，因此可在力的作用下变成任何形状，相当于二维流质[3]。细胞骨架是细胞的主要机械结构，它是一个极其复杂、动态的蛋白质纤维网络结构系统，由微管、微丝和中间纤维构成，介导了细胞的运动、附着、分子运输、细胞分裂以及蛋白质合成等功能[4]。细胞骨架结构的高度非线性特性，使细胞可以感知到细胞的形变和变化，完整的细胞骨架成分有助于细胞和细胞外基质(extracellular-matrix，ECM)之间更紧密地粘附。位于细胞膜上的整合素糖蛋白家族通过ECM与细胞内信号的相互作用来感知机械信号[5]。跨膜受体整合素是连接细胞骨架和ECM以传递机械信号的机械感受器，通过膜上钙通道来调节钙离子浓度，将胞外的各种信号传递至细胞内，引发细胞内信号的级联反应，进而调节细胞增殖及分化。

2 细胞力学与骨科的联系

2.1 细胞力学在骨科研究中的应用

目前细胞力学在骨科研究中的应用主要包括细胞整体形状、功能、变形及与力学性质有关的细胞骨架动力学与细胞-细胞外基质相互作用的机制；在细胞和分子水平上细胞粘附和泳动的生物力学；力学加载导致的细胞损伤；力学因素对骨细胞的生长、重建、信号转导、基因表达等过程的效应；力学信号诱导干细胞分化及其对生物学模式的影响等方面[2]。细胞力学与骨科学交叉、融合，形成了骨细胞力学，应用细胞力学的概念、方法和手段来研究与骨相关的基础性科学问题，解决骨关节疾病的临床实际问题[6]。

2.2 细胞力学在骨科研究中的作用机制

目前，细胞感受力学信号和进行信号转化的分子机理常见以下几种。首先附着于ECM是机械传递的必要条件。细胞膜感受力学刺激产生变形，并通过ECM粘附蛋白传递给细胞骨架。细胞骨架每个组成部分本身就是一个机械感受器，通过细胞骨架各种信号成分、结构蛋白和膜域在空间上被定位，以整合和传输机械感觉信号到细胞的机械效应器。整合素作为力的敏感蛋白，因细胞膜上的空间分布以及结构和调控基序的存在，使得其非常适合机械诱导。在力作用下，整合素改变其活性，从而影响细胞-细胞或细胞-ECM之间的黏附行为。

钙黏着蛋白调节细胞与细胞间的连接。钙黏着蛋白是一个完整的膜糖蛋白家族，细胞内结构域通过与多蛋白复合物结合，将钙黏着蛋白粘附在细胞骨架上，再通过细胞骨架调节细胞之间的连接，进而使细胞感知机械环境。

初级纤毛作为细胞力学感受机制之一，当纤毛弯曲时，膜上张力增加导致机械敏感离子通道开放，使细胞内Ca2+流入、膜去极化和神经纤维激活，进而细胞感受力学刺激。从机械刺激的骨细胞中暴露于条件培养基的骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)显示出对成骨基因的诱导效应，当骨细胞中的初级纤毛形成被抑制时，该效应被消除。

离子通道和连接蛋白常作为力学感受器。在外力作用下，骨组织细胞参与机械敏感性途径的多种离子通道时蛋白发生构型改变，实现力学信号向化学信号的转化。连接蛋白是跨膜蛋白六聚体复合物，每个复合物的亚基被称为连接子，在细胞质膜内形成孔，连接子与相邻细胞上对应的连接子对齐，产生称为间隙连接的功能连接。在机械力的刺激下，连接蛋白在体外和体内的表达增加，表明相邻细胞间产生增强的连接，从而能够在骨骼网络内适当地传递机械信号。

总之,所有的骨组织细胞有能力直接或间接地应对机械信号,经过力学信号转换系统，对负荷作出一系列反应，实现通过细胞间通讯和分泌因子去控制成骨细胞的骨形成和破骨细胞的骨吸收活动[4，7]。

3 骨细胞力学的研究进展

3.1 骨细胞力学的主要研究方法

应变力、剪切力、压力、流体流动、流动电位和加速度等特定因素均可对骨组织细胞产生外力加载作用，通过调节加载力的大小、频率、应变率等力学参数值，研究力学加载下骨组织细胞产生的影响[4]。在此主要论述现阶段细胞力学实验中常见的几种力学加载方式。

3.1.1机械拉伸法(Mechanical Stretch) 机械应变力可以通过多种方式施加，主要包括单轴和等轴两种。Zhao等[8]通过单轴机械拉伸，探索力作用下骨髓间充质干细胞中Wnt/b-Catenin通路的效应；Zhang等[9]通过等轴机械拉伸来探索机械力对人颅骨成骨细胞的细胞外基质相关基因表达的影响。机械刺激、整合素/细胞骨架/Src/ERK信号通路激活和骨细胞存活之间的联系为机械力在骨骼中的作用提供了机械基础[10]。

目前机械拉伸在细胞力学中，主要用于研究在机械拉伸作用下骨的一系列细胞形态及相关基因表达的改变，以及不同条件下促进骨重塑的最佳机械拉伸参数。近年，Parandakh等[11]通过细胞的重组和排列以及细胞骨架对平滑肌细胞的调节，发现周期性拉伸可以促进人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells ，hMSCs)的逐步重塑。机械拉伸也有助于大鼠骨髓间充质干细胞(rat mesenchymal stem cells ，RMSCs)定向分化为肌腱/韧带成纤维细胞[12]。等轴机械拉伸促进人颅骨成骨细胞(Human calvarial osteoblasts，HCObs)的EMC相关基因表达，增强细胞分化过程中的机械信号转导，从而达到促进骨重塑的作用[9]。Yu等[13]应用机械拉伸法研究力学环境下骨及周围组织细胞的行为，以及单个细胞的表型反应。研究表明，相关机械传导途径的激活将导致相应细胞群的表型反应增强。

研究机械拉伸对某种蛋白信号分子或离子通路产生的抑制或促进作用，可促进骨组织细胞分化、增殖等相关方向的研究。研究发现局灶粘连激酶(FAK)通过整合素信号通路会抑制体外机械拉伸模型诱导大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化[14]。单轴机械拉伸可以通过激活BMSCs 的Wnt/b- Catenin信号通路达到刺激BMSCs的成骨分化和增殖的作用[9]。通过周期性机械拉伸对FZD4受体的直接调控改变了BMSCs成骨分化相关基因的表达[15]。同时，周期性机械拉伸可提高BMSCs的碱性磷酸酶(ALP)活性、低氧诱导因子(HIF)-1α的表达及扭转，从而诱导骨髓间充质干细胞成骨分化[16]。Chen等[17]通过机械拉伸作用，激活AMPK-SIRT1信号通路，诱导hMSCs产生抗氧化反应和成骨分化，从而促进骨再生。此外，机械力还可调控miRNAs的表达，促进骨重塑，指导骨质疏松、骨折等骨疾病的治疗[18]。

将机械拉伸法与某些诱导因子联合，探索促进骨折愈合的最佳力学参数。研究表明机械拉伸与骨形态发生蛋白9 (BMP9)联合作用，可促进BMSCs的成骨分化[19]。此外，机械拉伸与20 IU/mL浓度的促红细胞生成素联合作用，也可对BMSCs的增殖和成骨分化起到相应促进作用[20]。

3.1.2流体剪切法(fluid shear stress，FSS) 研究表明，骨组织细胞会在FSS作用下发生明显的生物学效应[21]。在过去的几十年中，大量研究表明，骨组织细胞在不同流体流动模式和剪切力的作用下会产生不同的增殖效应[22]。

FSS作用下，骨的细胞上的某些自分泌信号对骨重塑和信号转导具有关键作用。McAllister等[23]首次报道了骨髓性细胞对FSS具有敏感性，在流动诱导的剪切应力刺激下，通过释放NO、PGE2、PGI2等自分泌因子来调节局部吸收活性，从而促进骨重塑和信号转导。细胞表面化学成分的不同使FSS的作用也不同；与—NH2表面相比，成骨细胞对—OH和—CH3表面具有更高的敏感性和更低的耐受性[24]。FSS通过瞬时受体电位阳离子的TRPV4通道促进成骨细胞增殖并诱导Ca2+内流和BMSCs的成骨分化[25]。通过ERK5负性调节Kruppel样因子4(KLF4)的表达，可以使KLF4负性调节，从而促进成骨细胞增殖[26]。

大量研究探索了FSS参数对骨重塑的影响。FSS可以破坏细胞与细胞的连接通讯，并重新排列连接蛋白，根据剪切应力的大小决定特异性连接蛋白的重新合成[27]。研究发现，骨的细胞在流体作用下产生的NO与FSS的速率成线性关系，应力的振幅和频率都有助于骨细胞的流动诱导激活[28]。并且FSS能够抑制破骨细胞的生成和骨吸收，不同的应力持续时间会引起破骨细胞的不同反应，并且机械应力能够调节成骨细胞和基质细胞的关键因子表达，诱导破骨细胞分化[29]。FSS分别在诱导早期(第4 d)和晚期(第8 d)增强和减弱成骨细胞的钙振荡[24]。此外，Mai等[30]通过研究证实了单次短时间FSS也可以促进成骨分化。

探究FSS与某些分子蛋白联合作用对骨重塑的影响，有研究发现FSS和褪黑素联合应用可以通过刺激细胞外信号调节激酶p-ERK的表达，从而促进成骨细胞的合成代谢反应[22]。

3.1.3流电位(streaming potentials，SPs)和压电性(Piezoelectricity) 流电位是由应力产生的流体流动形成的电场。经研究发现SPs可触发机械传导过程[31]。可从愈合皮质缺损的编织骨和重塑皮质骨中测量SPs，并且不同愈合阶段、不同部位之间的SPs /应变幅度差异似乎与骨阻抗和孔隙率有关，SPs的大小和频率均能为重构传递重要的结构反馈信息，额外的高频成分可能促进骨重建[32]。

Yasuda是第一个观察骨组织压电行为的研究者。随后，Thi等[31]系统地研究和测量了人和牛股骨干标本的正压电效应和逆压电效应。羟基磷灰石的中心对称晶体结构排除了观察这些压电性能的可能性，如去胶原骨。胶原的压电性可能影响zeta电位的大小，从而影响流动电位。因此，它可以间接地改变骨骼的硬度和流体动力学[33]。

此外，研究发现，光生物调节[34]、适当强度和频率的低强度脉冲超声(LIPUS)[35]、压缩力[36]，及低强度、低频机械振动(LMLF)[37]等力学加载方式也对骨重塑起促进作用。

3.2 细胞力学对几种主要骨的细胞的效应

3.2.1破骨细胞(osteoclast，OC) 骨吸收主要由OC介导，OC生成和功能受细胞因子控制，如OC分化因子(RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)[22]，以及受细胞内Ca2+振荡的调控。FSS通过机械敏感的阳离子选择性通道导致Ca2+振荡。OC的STIM1和TRPV4分别充当OC在分化早期和晚期的转导通道，钙通道可作为破骨细胞生成或骨吸收的标志[38]。此外，循环拉伸力可以抑制OC的凋亡[39]。通过施加最佳压缩力可以增加OC数量，释放该力后，OC的分化和融合受到抑制，可用于指导临床的正畸治疗[40]。

3.2.2成骨细胞(osteoblast，Ob) 成熟的Ob分化受Wnt信号通路控制，通常Wnt信号通路可被激素或机械激活[41]。Ob也可以通过自身的分泌机制直接调节骨基质的合成和矿化。骨吸收是由Ob通过作用于OC的旁分泌因子间接控制的。Ob的分化和成熟过程受力学和生化途径的双重调控。研究发现，Runt相关转录因子2(Runx2)在Ob前发育中必不可少，它激活Ob特异基因，包括骨桥蛋白、I型胶原、骨钙素和ALP[42]。RANKL受体激活剂的释放通过与OC前体表面的RANK受体结合来启动骨吸收[43]。在Ob即将凋亡时，Ob可以嵌入新形成的骨基质并分化为骨细胞，可以转化为保护非活性骨表面的非活性骨衬细胞，或启动凋亡[22]。周期性拉伸通过调节MG63细胞中肌动蛋白结合蛋白(Cofilin)mRNA的表达，cofilin参与了机械负荷诱导的成骨过程的调节，并且 cofilin对Ob机械转导十分重要[44]。但高水平的机械拉伸可诱导细胞凋亡，而骨膜素对机械拉伸诱导的Ob凋亡具有保护作用[45]。循环拉伸(在0.1 Hz时延伸率为10%)通过调节Akt/mTOR/p70s6k等信号通路，提高了人类Ob样MG63细胞能量代谢，从能量代谢的角度为Ob力学提供了新颖见解[46]。

3.2.3骨细胞(Osteocyte) 骨细胞可以同时对多种类型的负荷刺激作出反应，特别是对流体流动和静水压力更为敏感[47]。骨细胞通过在骨髓空间释放的分泌因子或直接进入血液循环，向远处的细胞或器官发出信号，从而感知机械刺激，并将这些信号转化为影响周围细胞的生化信号[6]。从Ob到骨细胞的分化过程中，细胞体积减小，细胞开始向矿化基质辐射，矿化基质可由早期骨细胞标志物E11/gp38控制[48]。机械刺激骨细胞通过压电1-Akt途径抑制编码硬结蛋白(Sost)的表达[49]。骨细胞转化后，ALP、I型胶原和骨形态发生蛋白2(BMP-2)的基因表达降低。其他蛋白质，包括骨钙素、E11/gp38、硬结蛋白(Sost)被上调或引入[50]。此外，周期性机械拉伸通过抗凋亡作用促进骨细胞样细胞的网络发育，通过上调LC3b和atg7的表达改变了骨细胞样细胞的大小和形状[51]。同时，骨样和缺氧条件的矿化也可能是骨细胞形成的驱动力[52]。

3.2.4骨髓间充质干细胞(BMSCs) BMSCs具有多种分化潜能，可作为细胞治疗和组织工程的自体细胞源[53]。机械拉伸可诱导细胞骨架重组，通过阻止细胞进入细胞周期的S期而抑制细胞增殖。尽管单纯机械牵张不能诱导C3H10T1/2mscs成骨分化，但机械牵张和骨形态发生蛋白9(BMP9)联合刺激可诱导BMSCs的成骨分化[54]。BMSCs在1 000 Hz应变(μs)s的循环机械负荷时，增强了Ob的活性，促进了BMSCs的Ob分化，并抑制了OC生成[55]。

4 讨论

虽然有大量研究探索了骨组织细胞在细胞应力作用下的影响和调节机制方面的相关内容，但这些细胞感知和传递机械信号进而转化为生物信号的转导系统的精确机制，仍然具有多样性、复杂性，难以阐述清楚。骨组织细胞在体内的生长环境复杂且独特，使得无法在体外精准复现体内生长环境模型，降低了体外骨组织细胞的增殖研究的可信性，无法充分说明骨组织细胞在机械应力作用下的体内效应。因此，通过加强科研人员学科综合交叉创新能力，推动科技发展，将细胞力学研究与临床需求紧密结合，有望在生物学和医学层面进一步阐明机械应力对骨组织细胞的作用机制，有助于指导临床治疗，拓展科研与临床应用相结合的细胞力学新思路。