养肝活血汤对酒精性肝病大鼠的影响*

赵红兵，张春雨，贾文霞，宋青，张英

呼和浩特市蒙医中医医院，内蒙古 呼和浩特 010010

长期酗酒可造成肝脏不同程度损伤，甚至导致死亡。酒精主要通过肝脏吸收代谢，同时过量酒精对肝脏危害极大。饮酒量越大，持续时间越长，就越容易引起酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD），却与酒的种类无相关性。ALD在欧美国家发病率较高，特别是美国，肝硬变死亡人数大约一半与长期酒精有关［1－4］。

酒精在很大程度损害肝脏，嗜酒者基本都有不同程度的脂肪肝，其中高达35%的饮酒者会发展为ALD，其中10%的ALD会发展为肝硬变。近几年，在中国ALD的发病率显著上升，已达6.1%。可引起肝硬变、肝纤维化，使机体的肝脏功能紊乱，人们生活健康受到很大的影响［5－7］。

ALD对人体的危害是不断发展的，从轻度脂肪肝发展到酒精性肝炎，进一步发展为酒精性肝纤维化，甚至肝硬变。在整个疾病发展过程中，这几种肝脏损害可以同时存在。ALD属于中医“胁痛”“酒疸”等范畴。根据临床表现，ALD、酒精性肝炎属于“胁痛”，酒精性肝纤维化、肝硬变相当于“酒癖”“酒臌”。ALD的病因病机包括痰湿、湿热、气滞血瘀等病因伤及肝脏，又因肝脾同病、肝肾同源，气、血、湿、痰等停于中下焦，气滞血瘀，凝结于腹中，形成酒臌证。

近些年，中医药治疗ALD多具有明显优势，笔者根据多年临床经验，自拟养肝活血汤治疗ALD，取得满意疗效。本研究应用养肝活血汤治疗大鼠ALD，检测天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransfease，ALT）及肝脏中磷酸化的c2Jun氨基末端激酶（phosphorylation－c2 JunN2 terminalkinase，p－JNK），观察白细胞介素－1β（interleukin－1β，IL－1β）和白细胞介素6（interleukin－6，IL－6）蛋白水平的变化，为今后临床治疗ALD奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物清洁级SD大鼠120只，雌雄各半，体质量150～170 g。质量合格证号：1100111911008773，湖南光琇高新生命科技有限公司。

1.2 药材与试剂养肝活血汤，药物组成：太子参10 g，玉竹10 g，黄精10 g，丹参10 g，水蛭10 g，赤芍15 g，黄芩10 g，郁金10 g，九香虫10 g，大黄6 g，甘草10 g，由呼和浩特市蒙医中医医院药房提供。橄榄油（Sigma公司）；吡唑（上海抚生实业有限公司）；硫普罗宁钠肠溶片（上海承良医药科技股份有限公司，批号A14202073232），由蒸馏水溶解。

1.3 分组与造模将120只SD大鼠按照随机数字表法分为空白对照组、模型对照组、养肝活血汤组、硫普罗宁钠组，每组各30只，均饲以普通饲料、自由进食，自由饮自来水喂养1周后，模型对照组、养肝活血汤组、硫普罗宁钠组饲以普通饲料，每天灌胃白酒、橄榄油、吡唑混合液，酒的摄入量为89～129 kg·d－1，随时间的延长而递增，橄榄油的摄入量为29 g·kg－1·d－1，吡唑摄入量为24 mg·kg－1·d－1，造模时间为12周。各组处死10只，观察造模是否成功［8］。

1.4 给药方法养肝活血汤组给予12.8 g·kg－1养肝活血汤灌胃（根据临床使用的成人每日服用剂量，剂量为成人的7倍）。硫普罗宁钠组给予60 mg·kg－1硫普罗宁钠水溶液灌胃。空白对照组及模型对照组均给予同体积的蒸馏水灌胃，每日1次。

1.5 观察指标

1.5.1 生化指标 造模第10天给药6 h后，收集大鼠血液，分离血清，检测AST、ALT水平。

1.5.2 Western Blot法检测大鼠肝脏中蛋白的表达提取大鼠肝脏中的蛋白质，检测各组大鼠肝脏中IL－6、IL－1β、JNK及p－JNK蛋白表达的变化。将大鼠肝脏中的蛋白质通过SDS－PAGE电泳，然后转膜到PVDF膜上，进行一抗孵育，二抗孵育，ECL液显色之后进行拍照，分析条带图像。

1.6 统计学方法应用SPSS19.0统计软件分析，正态分布计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况空白对照组大鼠行动灵活；模型对照组大鼠酒后挠嘴，走路不稳等；养肝活血汤组大鼠行动灵活，没有异常行为；硫普罗宁钠组大鼠行动灵活，没有异常行为。

2.2 各组大鼠血清中AST、ALT水平比较与空白对照组比较，模型对照组大鼠血清中AST、ALT均明显升高（P＜0.05），可见造模成功。与模型组比较，养肝活血汤组和硫普罗宁钠组大鼠血清中AST、ALT明显降低（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血清中AST、ALT水平比较 （s，IU·L－1）

表1 各组大鼠血清中AST、ALT水平比较 （s，IU·L－1）

注：与模型对照组比较，*P＜0.05

组别 n AST ALT空白对照组 30 41.13±2.11* 61.27±3.35*模型对照组 30 66.21±3.71 121.18±4.32养肝活血汤组 30 46.15±2.28* 83.12±5.23*硫普罗宁钠组 30 44.13±2.34* 75.14±6.38*

2.3 各组大鼠肝脏中蛋白表达结果与空白对照组比较，模型对照组大鼠肝脏中p－JNK、IL－1β、IL－6的蛋白表达水平明显增加（P＜0.05）；与模型组比较，养肝活血汤组和硫普罗宁钠组肝脏中p－JNK、IL－1β、IL－6的蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）。见表2、图1。

表2 各组大鼠肝脏中蛋白的表达

表2 各组大鼠肝脏中蛋白的表达

注：模型对照组比较，*P＜0.05

组别 n p－JNK／JNK IL－1β／β－actin IL－6／β－actin空白对照组 30 0.13±0.04* 0.11±0.05* 0.13±0.06*模型对照组 30 1.04±0.10 0.98±0.11 1.07±0.09养肝活血汤组 30 0.92±0.06* 0.62±0.08* 0.58±0.05*硫普罗宁钠组 30 0.66±0.11* 0.56±0.10* 0.54±0.07*

图1 各组大鼠肝脏中蛋白的表达

3 讨论

ALD在我国特别是在内蒙古自治区属于高发病［8］。酒精代谢所需要的两种主要酶为乙醇脱氢酶（Alcohol dehydrogenase，ADH）和乙醛脱氢酶（Acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）。酒精在机体氧化为乙酸，主要在肝脏代谢，通ADH和ALDH 来实现，其中乙醛毒性较强，也是乙醇在肝脏代谢中的重要产物［9－11］。同时，在人体中，乙醛可以与一些蛋白发生共价结合反应，产生活性不同的乙醛蛋白物。在乙醇氧化的过程中，主要变现为氧化型的辅酶Ι（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）向还原型辅酶Ι（Nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）转变，导致NADH／NAD比例增加。长期嗜酒者会对肝脏造成损害，可以减缓氧化型的辅酶I向还原型辅酶Ι的转变，延缓转变时间［12］。

ALD对人体的危害是不断发展的，从轻度脂肪肝发展到酒精性肝炎，进一步发展为酒精性肝纤维化，甚至肝硬变［13］。戒酒是治疗ALD的前提，改变饮食习惯，能减轻ALD患者的临床症状，实现氮平衡。目前，现有药物治疗不佳，很多药物还处于试验中［14］。而中医学治疗ALD具有较大的优势，通过辨证论治，结合经方治疗，取得满意的临床效果［15］。

本研究发现与模型对照组比较，养肝活血汤组大鼠治疗后血清中AST，ALT均降低，说明养肝活血汤能够抑制ALD的发展，改善肝脏功能。大量研究表明JNK途径对细胞的炎症因子的分泌有调控作用。为了进一步研究养肝活血汤的作用，本研究检测了大鼠肝细胞中炎性因子IL－1β和IL－6的变化，同样证明了养肝活血汤对大鼠肝细胞炎性因子的表达有抑制作用。为了进一步研究调控炎性因子表达的机制，本研究检测了p－JNK的情况，表明养肝活血汤对ALD p－JNK的表达有抑制作用。这就说明，养肝活血汤对ALD炎性因子的表达调控通过p－JNK来实现的。

ALD在疾病发展的各个阶段中，对人体的损害仅次于传染性肝病。肝脏是人体最主要的代谢脏器，起着非常重要作用，而酒精往往对肝脏损伤最大［16－17］，中医学在治疗ALD具有较大的优势，通过辨证论治，取得满意的临床效果。同时中药对肝硬变、肝纤维化的治疗疗效较好，目前，对ALD的研究存在一定的问题，一是对ALD的辨证论治、病因病机及疗效制定标准没有形成共识；二是没有科学设计、合理对照及明确的检测手段［18］。没有中医辨证论治与检验指标及肝组织病变相关性的研究，无法明确ALD处于哪个发展阶段，属于哪种证型。没有明确的对照药物，对不同的证型提供不同的有效对照药。这些问题造成中药治疗ALD的研究处于较低水平［19］。

因此，养肝活血汤治疗ALD，能够抑制大鼠肝细胞IL－1β和IL－6的表达，为今后的临床治疗提供了实验基础。