基于响应面优化法的新型生物纳米材料的制备及应用*

张涛

（1.福建师范大学 环境科学与工程学院，福建 福州 350007；2.福建省污染控制与资源循环利用重点实验室，福建 福州 350007）

随着纺织工业的发展，印染废水中残余的有机染料所造成的环境污染已经是一个全球关注的问题。残余的有机染料大多含有芳香烃官能团且能够发生电离，其复杂的合成来源和分子结构使其难以通过微生物降解等方法彻底去除[1,2]。孔雀石绿（MG,malachite green），是一种广泛用于纺织品的染色和治疗鱼类微生物感染的人工合成的三苯基甲烷有机染料，其大量的使用会干扰自然光在水中的渗透度，导致自然水体和人工水体中水生植物的光合效率降低，从而影响水体中的含氧量，抑制水中生物的活性[3]；同时MG对人体有一定的毒性，孔雀石绿中的三苯甲烷分子与苯环相连的亚甲基和次甲基均易受到苯环的影响从而具有较高的反应活性，可生成致癌官能团之一的三苯甲基，能抑制人体内谷胱甘肽-S-转移酶的活性，并与人体DNA嵌合生成有毒的加合物。这种情况会造成人体器官组织氧压的改变和脂质过氧化，导致细胞凋亡，诱发肿瘤产生[4]。因此，印染废水中残余的孔雀石绿的去除是目前纺织污水处理中亟需解决的问题之一。

氧化石墨烯（GO, graphene oxide）已在环境修复领域中应用并得到了广泛的认可，但是这种技术在实际生产和使用过程中还存在一些局限性，例如氧化石墨烯合成工艺中的还原过程需要运用到大量的有毒有害化学试剂，这些化学试剂对人体健康和环境会造成一定的危害。氧化石墨烯在溶剂中的相容性较差，不易分散的性质严重限制了其应用效果等[5]。而传统的微生物降解技术中的游离菌也容易受到微生物量不足，保留时间短以及降解效果波动性大等因素的影响，其对污染物的降解效果和稳定性不够理想[6]。综上所述，为了克服以上这些技术发展的限制，需要研制一种新型复合生物材料去除印染废水中的有机染料，而将绿色还原氧化石墨烯技术与微生物降解技术相结合则是目前环境修复领域较为热点的研究之一。

本研究中提出了一种简单且环保的生物复合材料制备技术，以甘蔗渣为还原剂，采用Box-Behnken响应面优化法优化合成还原氧化石墨烯（B-RGO,bagasse reduce graphene oxide）工艺参数，并负载具有可降解染料污染物MG能力的洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）制备生物纳米材料（MNMs,Microbial nano-materials）[7]。同时采用气相色谱-质谱（GC-MS）分析MNMs对孔雀石绿的降解产物。

1 材料及方法

1.1 实验材料与仪器

孔雀石绿（MG, malachite green）分子式：C23H25N2，为AR级，购自国药集团化学试剂有限公司。

其他主要试剂：氯化铁、硫酸镁、氯化钠、无水乙醇、硝酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、葡萄糖、酵母胨均为AR级，购自国药集团化学试剂有限公司。

主要大型仪器：原子吸收光谱240AA，购自安捷伦科技有限公司；紫外可见光谱UV1902，购自上海凤凰城；气相质谱联用仪MSD5977，购自安捷伦科技有限公司；真空干燥箱DZF-6020，购自上海精宏实验设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 洋葱伯克霍尔德菌的培养和悬浮液制备

洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）购自上海北诺生物科技有限公司。

在培养环境条件为30 ℃，摇床转速为150 r/min，将洋葱伯克霍尔德菌在液体培养基中连续培养18 h以上，然后取适量样品在转速4000 r/min下离心10 min，离心去除上清液，收集下层的生物质，用磷酸盐缓冲液将其稀释为OD600=0.7的细胞悬浮液。

1.2.2 氧化石墨烯的制备

采用改进的Hummer方法制备氧化石墨烯悬浮液[5]。

1.2.3 甘蔗渣还原液的制备

用去离子水洗涤甘蔗渣3次，在烘箱中60 ℃下干燥24 h并研磨3次形成细腻均匀的粉末。再将4 g甘蔗渣粉末和300 μL硫酸加入去离子400 mL水中，在60 ℃下加热5 h，然后冷却至室温后放置于冰箱中备用。

1.2.4 甘蔗渣还原氧化石墨烯的制备

取400 mL甘蔗渣还原液加入到400 mg/L的氧化石墨烯悬浮液中，然后在90 ℃， 150 r/min条件持续搅拌超过8 h，再将混合液以4000 r/min离心30 min收集沉淀并真空冻干48 h以制得固体材料还原氧化石墨烯（B-RGO）。

1.2.5 MNMs制备

将培养的1 5 mL 洋葱伯克霍尔德菌悬浮液（OD600 =0.7，体积分数=1.5%）与还原氧化石墨烯（B-RGO）颗粒混合置于含有矿物盐培养基的锥形瓶中，并放置于振荡培养箱中在150 r/min和30 ℃条件下持续培养24 h，直至所有细胞被固定在还原氧化石墨烯（B-RGO）的表面上。然后收集复合材料，获得制备好的MNMs。

1.2.6 气相色谱-质谱（GC-MS）

MG降解产物通过GC-MS进行检测。GC-MS柱为DB-5ms毛细管柱（30 m×0.25μm×0.25μm），进样温度250 ℃，烘箱温度50 ℃恒温1 min，然后以15 ℃/min的速率升温至290 ℃，在290 ℃下保持15 min。气相色谱-质谱系统在全扫描（m/z 100-700）下运行。

1.2.7 去除效率的计算

去除效率W计算公式：

式中：

C0——孔雀石绿被吸附量的初始浓度，mg/L；

Ct——孔雀石绿被吸附量反应后的浓度，mg/L；

W——去除率。

1.2.8 单影响因素实验设计

考察在不同的氧化石墨烯投加量（200、300、400、500 mg）及氧化石墨烯的还原反应温度（353、363、373 K）和还原时间（8、12、16 h）条件下，所制备的MNMs去除水溶液中孔雀石绿的效率。

1.2.9 Box-Behnken响应面实验设计

对比单因素试验结果的显著性，以合适氧化石墨烯投加量及还原温度和还原时间为因素，以孔雀石绿的去除率为响应值，选择3水平进行试验，因素与水平设计见表1。

表1 响应面优化实验因素及水平

2 结果与讨论

2.1 单影响因素实验结果与讨论

2.1.1 氧化石墨烯投加量对孔雀石绿去除效果的影响

图1 氧化石墨烯投加量对孔雀石绿去除效果的影响

由图1可知，MNMs对孔雀石绿的去除效果随着氧化石墨烯的投加量增加呈现先上升后下降的趋势，但总体影响不大，在投加量为400 mg是去除孔雀石绿的效率最高为95.1%，可能是MNMs有更多的吸附位点能够吸附降解去除孔雀石绿[8]。

图2 还原反应温度对孔雀石绿去除效果的影响

2.1.2 还原反应温度对孔雀石绿去除效果的影响 由图2可知，在温度范围为353～373 K内，较低的反应温度下合成的MNMs对孔雀石绿的去除效果低于较高反应温度下合成的MNMs，可能是较低的温度不利于氧化石墨烯的还原，因此合成反应温度可选较高的范围。

2.1.3 还原时间对孔雀石绿去除效果的影响

图3 还原时间对孔雀石绿去除效果的影响

由图3可知，还原氧化石墨烯（B-RGO）的合成时间对孔雀石绿的去除效率有一定的影响，反应时间为8 h的材料对孔雀石绿的平衡去除率只能达到86.4%，而反应时间在12～16 h的材料对孔雀石绿的平衡去除率均在90%左右，说明在一定时间范围内，较长的反应时间对氧化石墨烯的还原更完全[9]，材料的去除效果更好。

2.2 响应面实验结果与分析

2.2.1 响应面优化实验设计与结果

根据Box-Behnken实验设计对孔雀石绿去除率影响的3个单因素(氧化石墨烯投加量、氧化石墨烯还原温度、时间)进行组合试验设计出17组实验，实验的结果见表2。

2.2.2 方差结果与分析

运用Design-Expert 12软件，将得到的孔雀石绿去除率与氧化石墨烯投加量，材料合成温度和时间进行响应面回归分析，得到四元二次回归方程：

表2 响应面实验设计与结果

表3 回归模型方差分析与结果

Y=96.00+1.48A+0.775B+1.67C+0.575AB-1.03AC-0.525BC-3.71A2-5.56B2-4.26C2

其中Y为孔雀石绿的去除率。通过软件分析得到回归模型方差分析，结果如表3。

由表3可知，此失拟项P值=0.4899＞0.05，说明此实验的非试验因素影响小且误差小，失拟项不显著。R2=0.9874，RAdj2=0.9712说明该模型所得出的实际值和预测值有较好的拟合度，回归模型与实际实验的拟合程度较好，可用来分析孔雀石绿的去除率与3个因素之间变化趋势的预测[10]。由各影响因素的F值可知，对孔雀石绿去除率影响因素的主次顺序为C＞A＞B，即反应时间＞氧化石墨烯投加量＞反应温度。

图4 氧化石墨烯投加量与反应温度对孔雀石绿去除率的影响

图5 氧化石墨烯投加量与反应时间对孔雀石绿去除率的影响

图6 反应温度与时间对孔雀石绿去除率的影响

通过Design-Expert 12软件对响应值Y（孔雀石绿去除率）与3个因素（A：氧化石墨烯投加量；B：反应温度；C：反应时间）构成的3D响应面图及等高线图，以反映各因素（AB、AC、BC）其交互作用对孔雀石绿去除率的影响。3D响应面图的倾斜度表示了其中2个因素的交互作用对响应值的影响程度，倾斜度越高则说明该因素对响应值的影响越显著；等高线图的椭圆率代表了交互作用是否显著，等高线越趋近于圆形代表交互作用不显著，反之椭圆形趋势的等高线则表示具有显著的交互性[11]。由图4、图5、图6可知，AB、BC的交互作用相比AC的交互作用较为显著，此结果与表3中的分析结果一致。经分析可得最优参数为：氧化石墨烯投加量为399.1mg，反应温度为367 K，反应时间为13.5 h。

2.3 GC-MS分析

图7 MNMs去除孔雀石绿的产物分析

图8 孔雀石绿可能的降解途径

采用GC-MS对孔雀石绿及降解后的产物进行分析，使用NIST数据库进行鉴定。如图3可知，当保留时间为25.5 min经鉴定为孔雀石绿的峰，经过60 h的微生物降解后，在保留时间为6.5 min时出现一个新峰，在保留时间为21.5 min时也出现了一个新峰，对比NIST数据库被证实降解产物是N,N-二甲基苯胺（m/z136；主要片段：136、121、94、65、39）和4-（二甲基氨基）二苯丙酮（m/z 225；主要片段：225，148，132，105，77）。其降解途径可能是共轭显色基团结构裂解产生了氨基苯衍生物，生成了N,N-二甲基苯胺（C8H11N）和4-（二甲基氨基）二苯甲酮（C15H15NO）[12]。

3 结论

⑴ 响应面优化法得到的最优制备因素：氧化石墨烯投加量为399.1 mg，反应温度为367 K，反应时间为13.5 h。在孔雀石绿初始浓度为50 mg/L的水溶液中有95.5%的孔雀石绿最后被MNMs去除。

⑵ GC-MS分析证实孔雀石绿最终被伯克霍尔德菌降解为N,N-二甲基苯胺（C8H11N）和4-（二甲基氨基）二苯甲酮（C15H15NO），这可能是因为孔雀石绿中的共轭显色基团结构裂解而产生了氨基苯衍生物。

本研究证实绿色还原氧化石墨烯固定伯克霍尔德菌的微生物纳米材料是一种具有去除染料废水中有机污染物效果良好的功能性生物纳米材料。该纳米材料制备过程简便，经济性好，去除效果显著的特点而使其在印染废水处理工程中具有广阔的应用前景。