顶空固相微萃取-气质联用分析不同烹制时间红烧肉挥发性风味成分

朱文政，严顺阳，徐艳,2，王秋玉,2，张慢，张慧敏，周晓燕,2*，杨章平*

1(扬州大学 旅游烹饪学院，江苏 扬州，225127)2(江苏省淮扬菜产业化工程中心，江苏 扬州，225127)3(扬州大学 动物科学与技术学院，江苏 扬州，225009)

红烧肉是深受消费者喜爱的中华传统美食之一[1]，因其肥而不腻、瘦而不柴、软烂适度、色泽红亮、味道浓郁、鲜美可口的特点深受大众的喜爱。红烧肉的烹制技法源远流长，研究表明，烹饪会使食物的物理和化学性质发生一系列变化[2]，烹制时间和火候对红烧肉营养品质和风味有很大影响。

近年来，关于红烧肉风味的研究主要集中在猪肉的品种、红烧肉类别和烹饪方法等因素对红烧肉挥发性风味的影响。文献研究表明，烹制方式和烹制时间的差异形成了不同红烧肉独特的风味感官特征，红烧肉加工过程中脂类物质分解与氧化对风味的形成有很大影响[3-10]。文献表明，脂肪氧化和脂肪酸组成变化对肉制品的营养和风味产生重要影响。肉中不具有挥发性的风味物质前体经过热诱导后产生一系列复杂化学反应最终形成了多种挥发性化合物，从而产生肉特有的风味[11]。

本实验以苏式红烧肉为基础，结合中国烹饪大师的经验和烹制技法，以不同烹制时间下的红烧肉为研究对象，通过固相微萃取结合气相色谱-质谱联用技术(solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS)，分离鉴定红烧肉的风味物质[12]，采用内标法，确定不同烹制时间段红烧肉的主体风味活性物质，为红烧肉的工业化生产加工及风味评价提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冷鲜猪五花肉(三元杂交猪)、小葱、生姜，购于扬州麦德龙超市；色拉油，金龙鱼调和油；精选老抽、精选生抽,李锦记食品有限公司；绍兴花雕酒，浙江古越龙山绍兴黄酒股份有限公司；青岛啤酒，青岛啤酒股份有限公司；白砂糖，南京甘汁园糖业有限公司；食盐，大连盐化集团有限公司。辛酸甲酯标准品，美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

C21S-C2170九阳电子炉，九阳股份有限公司；分析天平(BS210S(1/10000)型)，赛多利斯仪器系统有限公司；MK-301型热电偶接触式测温仪，杭州美控自动化技术有限公司；恒温水浴锅(HH-4A型)，国华电器有限公司；CarboxenTM/聚二甲基硅氧烷萃取头(75 μm)、57330-U手动固相微萃取进样器，美国Supelco公司；气相色谱-质谱联用仪(Trace ISQ II)，美国热电公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品制备

将五花肉原料，放入冷水锅中煮至断生(中心温度达到65 ℃)，然后取出晾凉切割成规格3 cm×3 cm×2 cm的块状，称取1.0 kg，备用。锅中放入色拉油15 g，加入块状的五花肉用800 W火力煸炒，然后加入小葱12 g、姜12 g、料酒15 g，将五花肉煸炒出油，再加入老抽30 g、生抽30 g、啤酒300 g、白砂糖50 g、食盐2 g，加入农夫山泉矿泉水1 500 mL，用1 200 W火力将汤汁烧沸后，改用500 W火力烧制2.5 h。为研究动态红烧肉烹制过程中挥发性成分的变化，取原料肉、烹制30、60、90、120和150 min，这6个时间段的肉为研究对象。烹制完成后，将样品晾凉绞碎，贮藏于-40 ℃，备用。

1.3.2 挥发性风味物质的测定

将待测样品置于4 ℃条件下缓慢解冻，称取10.0 g样品转移到20 mL萃取瓶中，加入60 μL 0.012 66 mg/mL的辛酸甲酯内标，然后快速用锡纸和封口膜密封瓶口。将经250 ℃老化1 h后的萃取头穿过顶空瓶口的橡胶密封塞插入到萃取瓶中，并在60 ℃水浴加热条件下顶空萃取40 min，萃取结束后迅速拔出萃取头插入气相色谱质谱联用仪进样口，启动气相色谱质谱联用仪采集数据并进行分析、鉴定。

色谱柱为DB-Wax(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，载气为氦气。流速为1.0 mL/min，不分流进样，进样口温度为250 ℃；升温程序：起始温度为40 ℃，保持2 min，以4 ℃/min升到120 ℃，再以8 ℃/ min升到240 ℃，保持7 min。质谱条件：离子源温度240 ℃；电离方式EI；电子能量70 eV；灯丝电流150 μA；质量扫描范围：30～450m/z。

1.3.3 定性与定量分析

根据检索库(NIST 2011)进行化合物的质谱分析鉴定，在检测出的挥发性风味成分中筛选出正匹配度和逆匹配度均大于800的化合物。定量方法：根据辛酸甲酯内标峰面积，计算待测样品中挥发性风味物质含量，计算如公式(1)所示：

挥发性风味物质含量/(mg·kg-1)

(1)

参照刘登勇等[13]的方法，采用气味活度值(odor activity value，OAV)计算确定红烧肉中的主体风味成分，OAV值，是指嗅感物质的绝对浓度(C)与其感觉阈值(T)之比，计算如公式(2)所示：

(2)

1.4 数据处理

每个样品重复3次，采用Excel软件和SPSS 17.0软件中的单因素方差分析(ANOVA)法和Duncan多重比较法对样品数据进行处理与分析，分析结果以平均值±标准差表示，以P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 SPME-GC-MS检测结果及挥发性风味物质鉴定

采用SPME结合GC-MS萃取并检测不同烹制时间过程中红烧肉的挥发性物质。由表1可知，红烧肉中共鉴定出93种化合物，包括烃类40种、醇类19种、酯类11种、醛类8种、酮类8中、酸类1种、其他类6种。不同烹制时间组中检测的挥发性化合物有差别且总挥发性物质含量存在显著差异(P<0.05)，红烧肉在烹制过程中，随着烹制时间的延长，其挥发性物质种类数量检出呈先增加、后减少、再增加的趋势。表2统计分析了不同烹制时间过程中鉴定出不同化合物的种类与数量。从统计结果来看，原料肉中检测出48种挥发性风味物质，加热至30 min时，烃类物质和醇类物质种类增加，加热至60 min时总计检出61种挥发性物质，其中醛类风味物质，原料肉中检出3种风味物质，加热至150 min时增加至7种风味物质。

表1 不同烹制时间的红烧肉挥发性化合物成分

续表1

续表1

表2 不同烹制时间的红烧肉挥发性化合物数量统计

化合物含量的高低不能说明其对风味的贡献度大小，通过计算各挥发性风味化合物香味阈值，进行OAV分析。通过查询，共找到22种挥发性风味化合物的香味阈值，如表3所示，红烧肉的OAV值≥1的有9种，按照风味贡献程度从大到小依次为壬醛、己酸甲酯、己醛、反-2-庚烯醛、1-辛烯-3-醇、2-戊基呋喃、2-庚酮、2-戊酮、3-羟基-2-丁酮。在烹制过程中，瘦肉和脂肪组织的非挥发性成分之间会发生一系列复杂的热诱导反应，产生大量的反应产物[17]。五花肉在烹饪过程中会发生复杂的化学变化，美拉德反应、脂肪降解等途径是产生挥发性风味物质的重要原因[18]。

表3 红烧肉中主要的挥发性物质的阈值及OAV

2.2 醛类风味物质含量差异比较分析

醛类物质来源于脂肪氧化降解[19]。醛类物质是红烧肉中主要挥发性风味化合物。醛类物质具有较强的挥发性，浓度高且阈值较低，是熟肉中重要的风味化合物[14]。红烧肉在烹制过程中，醛类风味物质随着烹制时间的延长而产生，烹制90 min时，己醛检出量达10.86 mg/kg，烹制120 min时，检测量达到29.14 mg/kg，至150 min时，检出量降低至22.75 mg/kg。此外，壬醛加热至120 min时检出，含量为11.15 mg/kg。此外烹制达到一定时间后也会产生庚醛、十八醛、十二醛、苯甲醛等物质。这几个醛类物质，己醛具有清香的青草香，壬醛具有清香，庚醛具有油脂香和果香味，而且这几类醛类物质的阈值也相对较低[20-21]。己醛和庚醛主要由亚油酸和花生四烯酸氧化产生[22]，壬醛主要由于油酸氧化产生[23]。通过红烧肉OAV值分析，壬醛OAV值为12.17，己醛OAV值为6.48，2-庚烯醛为6.43，表明它们在红烧肉香气中起重要作用。随着烹调温度的升高，挥发性化合物的形成和脂质氧化增加，这说明脂肪氧化产生的化合物对熟肉的风味有很大的影响[24]。总体来看，醛类物质的种类和含量随烹制时间延长呈上升趋势。

2.3 醇类风味物质含量差异比较分析

醇类物质主要来源于脂肪的氧化分解[25]。红烧肉烹制过程中共鉴定出19种醇类物质，大部分的醇类物质都是从原料肉就含有，随着烹制时间的增加，含量呈先升高后降低的趋势。醇类物质中，正戊醇、正己醇、1-辛烯-3-醇、2-癸烯-1-醇是红烧肉中主要风味物质，其中以正己醇和1-辛烯-3-醇含量最高，分别为18.93 mg/kg和18.19 mg/kg，其次为正戊醇、2-癸烯-1-醇含量相对较高。研究显示，1-辛烯-3-醇香气性质具有蘑菇香味，1-辛烯-3-醇具有较强的蘑菇香味[26]。从烹制时间趋势上来看，烹制时间对红烧肉的醇类物质影响较大，在烹制90 min和120 min时醇类物质的含量达到最大值，继续加热时部分醇类物质含量下降。

2.4 酮类风味物质含量差异比较分析

酮类物质可以通过不饱和脂肪酸受热氧化后降解[27]，也可以通过美拉德反应产生[28]。酮类物质阈值较低，常有清香气味，对红烧肉的整体风味具有一定的影响。红烧肉在烹制过程中共鉴定出8种酮类物质，在原料肉中鉴定出3-辛酮、2-庚酮和2-戊酮，其中3-羟基-2-丁酮、4,6,8-三甲基-1-壬酮这2种酮类物质在开始烹制之后就已经产生了，并且随着烹制时间的增加总体的含量也在增加，在烹饪时间为120 min时达到最大值。酮类在红烧肉中种类较少且相对含量低，因此对红烧肉风味贡献不突出。

2.5 酯类风味物质含量差异比较分析

酯类物质由肌肉组织中脂质氧化所产生的醇和游离脂肪酸之间的相互作用所产生[29]。在酯类物质中，己酸甲酯、硅烷二醇二甲酯含量较高，前者在原料肉中、30 min和60 min时间段检出，而60 min后未检出，后者则相反，烹制120 min和150 min时检出，含量为2.63 mg/kg和2.87 mg/kg。酯类物质是由酯化反应和各种产物之间的相互作用产生的，酯类物质的阈值较高，对风味的影响较小。短链脂肪酸与醇类物质生成的酯类物质呈果香味，而长链脂肪酸与醇类物质生成的酯具有油脂味。总体上看，酯类物质的种类较少，占总的挥发性风味物质相对含量较小。

烯烃类物质中以β-蒎烯含量最高，烹制120 min时，其含量为10.78 mg/kg，可能是烹制过程中红烧肉发生脂质过氧化反应产生烃类物质，而烹制时间的延长则使部分烃类化合物转化为杂环类化合物。烃类化合物阈值较高，单独烃类对风味贡献不大，但多种烷烃及烯烃的协同作用可能对肉的风味有整体贡献[30]。其他类风味化合物主要由呋喃类、杂环类等物质组成，它们通常都是阈值较低，但对风味影响较大。呋喃类物质是由脂质氧化产生的，赋予肉制品良好的风味，挥发性物质中检测到一种含量较高的呋喃类物质2-戊基呋喃(OAV>1)，这种物质有甜香[31]，对红烧肉的风味影响较大。硫醇化合物常见于低温(70～100 ℃)烤肉中[32]。

3 结论

本文应用SPME-GC-MS技术，对不同烹制时间(原料肉、30、60、90、120、150 min)的红烧肉中挥发性风味成分进行测定。研究结果显示，红烧肉在烹制过程中共鉴定出93种挥发性化合物。根据不同类风味物质的聚类和OAV值分析，烹制时间对红烧肉挥发性风味化合物有显著影响，从检测出的风味物质含量来看，醛类、酯类、呋喃类是红烧肉烹制过程中的主要风味物质，随烹制时间的增加，其含量显著增加(P<0.05)，烹制150 min时，己醛含量达到22.75 mg/kg，壬醛含量达到12.17 mg/kg，通过OAV值分析发现，己醛、壬醛、2-庚烯醛(OAV>1)等风味化合物是红烧肉烹制90、120和150 min主要贡献的香味风味物质；此外，呋喃类物质2-戊基呋喃(OAV>1)是红烧肉主要特征香味风味物质。该结论与SONG等[33]研究红烧肉检出的戊醛、壬醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、苯乙醛、十二烷和芳樟醇等物质相似。研究结果为后续深入研究红烧肉的品质形成和精准调控提供依据。