辣木叶不同极性部位对细胞的抗氧化及抗增殖活性研究

王丽虹，刘阳*，许悦，熊凡，潘敏怡，王语嫣

（1.武昌理工学院生命科学学院，生物多肽糖尿病药物湖北省协同创新中心，湖北省生物多肽糖尿病药物工程技术研究中心，湖北 武汉 430223；2.武汉工程大学环境生态与生物工程学院，湖北 武汉 430073）

人体正常生命活动中会生成自由基，自由基过多或身体自身清除过慢，都会对人体的健康造成一定影响。大量研究显示，自由基与多种疾病的发展有着密切的关联[1]。人工合成抗氧剂在食品工业中被广泛使用，但毒理学和生物学研究发现，人工合成抗氧剂对人体健康安全存在威胁[2-3]。许多研究证实了天然产物中所含的黄酮类物质有抗氧化的功能，因其安全性高，在抗氧剂研发中极具潜力和应用价值[4-5]，因此具有较高的研究价值和开发前景。

辣木（Moringa oleifera Lam）属于辣木科（Moringaceae）辣木属（Moringa Adans）落叶乔木[6]，为药食两用植物，其含有的黄酮含量达到31.28 mg/g。曾有学者对辣木叶醇提物的自由基清除能力进行研究，发现在相同浓度下其抗氧化活性能与人工合成抗氧剂相媲美[7]，这表明辣木叶是一种具有开发潜力的天然抗氧剂原料。有研究发现，辣木叶甲醇提取物减轻了糖尿病大鼠肝脏的炎症，显示了肝脏保护作用[8]。辣木叶还具有抗癌的功能，其抗癌活性被证实主要来源于其含有的槲皮素、烟碱甲素[9-11]。前期研究中采用化学方法发现辣木叶不同极性部位均有清除自由基的能力，为进一步研究其抗氧化活性，本文以H2O2诱导HepG2细胞损伤为模型，通过生化分析方法测定细胞丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量及总超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、过氧化氢酶（catalase，CAT）活力，评价辣木叶不同极性部位的抗氧化能力，并对HepG2细胞的抑制作用进行研究，旨在筛选活性较强的极性部位。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人肝癌细胞系HepG2细胞由武汉大学病毒学国家重点实验室惠赠。

辣木叶：云南大药山商贸有限公司；纤维素酶（10万U/g）、果胶酶（5万U/g）：宁夏和氏璧生物技术有限公司；DMEM高糖培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素混合溶液、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）溶液：海克隆生物化学制品（北京）有限公司；噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）：上海源叶生物科技有限公司；GSH-Px测定试剂盒、CAT测定试剂盒、MDA测定试剂盒、SOD测定试剂盒：南京建成生物工程研究所；其它试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

倒置相差荧光显微镜（TE2000-5）：日本尼康公司；二氧化碳培养箱（MCO-15AC）：松下健康医疗器械株式会社；生物安全柜（BHC-1300ⅡB2）：苏州安泰空气技术有限公司；高速离心机（HC-3018）：安徽中科中佳科学仪器有限公司；电子分析天平（A223 S-CW）：德国赛多利斯公司；酶标仪（Infinite F200）：瑞士帝肯公司。

1.3 方法

1.3.1 辣木叶不同极性部位的制备

称取干燥辣木叶粉1 g、纤维素酶20 mg、果胶酶40 mg，加入浓度为 88%的乙醇，料液比为 1∶26（g/mL），超声45 min后置于60℃的水浴锅酶解25 min，提取辣木叶总黄酮，得总醇提液（M），并按石油醚、乙酸乙酯、正丁醇顺序依次萃取，萃取液经旋蒸、干燥，分别制得辣木叶石油醚部位（M1）、乙酸乙酯部位（M2）、正丁醇部位（M3）和水溶性部位（M4），经检测 M、M2、M3、M4 中总黄酮含量依次为 （100.56±1.49）、（326.19±2.35）、（209.39±1.16）、（45.40±2.11）mg/g，M1 含有极少量的总黄酮，故舍去。试验时用完全培养基配制成不同浓度无菌溶液。

1.3.2 HepG2细胞复苏

取出含HepG2细胞的冻存管于37℃水浴锅中快速解冻，加37℃预热DMEM高糖培养基混匀，1 000 r/min离心5 min后弃去最上层液体，迅速加入含有血清和双抗的完全培养基，用移液枪头轻轻地吹打细胞至完全分散后将其转移至培养瓶，置于37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中进行培养。

1.3.3 H2O2诱导HepG2细胞氧化损伤模型的建立

将对数生长期的细胞，用细胞计数板调整细胞数至 1×105个/mL，按 100 μL/孔接种于 96 孔板后于培养箱中培养。待细胞贴壁生长后，弃去原培养基，模型组加入100 μL用完全培养基配制的50 μmol/L～1 000 μmol/L H2O2溶液，正常组和调零组（不添加细胞）分别加入相同体积的完全培养基[12]。每组5个复孔，培养2 h后弃去上层培养液，按10 μL/孔加入5 mg/mL MTT溶液后于培养箱中培养4 h，吸弃上层液加入二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）150 μL/孔，低转速摇晃10 min使结晶溶解充分，后用酶标仪于490 nm处测定各孔OD值。用公式（1）计算细胞存活率。

1.3.4 辣木叶不同极性部位给药剂量的筛选

将1.3.3中的H2O2溶液用0.1mg/mL～5.0mg/mL辣木叶不同极性部位溶液代替，培养24 h后按照1.3.3的步骤，加入MTT溶液测定细胞存活率，筛选出对HepG2细胞安全无毒的剂量范围[13]。

1.3.5 辣木叶不同极性部位对H2O2损伤细胞的保护作用

向模型组中加入安全浓度的辣木叶各极性部位溶液继续培养24 h后吸去上层液，加入用完全培养基配制的400 μmol/L H2O2溶液，培养2 h后，按1.3.3操作步骤检测细胞存活率。

1.3.6 细胞氧化酶活力检测

同1.3.5的步骤，H2O2处理细胞2 h，收集培养液后离心取上清液待测；细胞用冷的磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗2次后加入胰蛋白酶-EDTA溶液消化、离心收集，在冰浴中用RIPA裂解液裂解细胞，待测[14]。参照相应试剂盒方法，测定细胞培养液及细胞中MDA、SOD、GSH-Px以及CAT水平。

1.3.7 辣木叶不同极性部位对细胞增殖的影响

依照1.3.4的操作，用MTT法分别检测辣木叶不同极性部位作用于HepG2细胞24、48、72 h时的存活率，并利用软件计算半数抑制浓度（IC50，mg/mL）。

1.4 数据处理

试验结果用平均值±标准差表示，数据采用SPSS软件进行统计分析，用方差分析法进行显著性检验，绘图采用Origin Pro 8.0。

2 结果与分析

2.1 H2O2诱导HepG2细胞损伤浓度的确定

H2O2是一种活性氧，是人体新陈代谢过程中的中间产物，它极易穿透细胞膜作用于一些生物大分子，引起脂质过氧化等一系列反应，是建立细胞氧化损伤的常用物质[15]。HepG2细胞因有和人体正常肝细胞相同的功能，所以常被用在探究天然抗氧化活性产物对细胞保护作用的试验中[16]。不同浓度H2O2对HepG2细胞存活率的影响见图1。

图1 不同浓度H2O2对HepG2细胞存活率的影响Fig.1 Effect of different concentration of H2O2on the survival rate of HepG2 cells

由图1可知，H2O2对细胞的氧化损伤随浓度的增大而增强，当 H2O2浓度为 200、400、800μmol/L 时，HepG2细胞存活率分别为（74.33±2.44）%、（64.73±1.52）%、（35.30±3.10）%。由于低浓度H2O2对细胞损伤较轻，样品对于细胞的保护作用不明显；而浓度过大又会对细胞造成不可逆转的损伤，所以一般应选择细胞存活率在50%～70%范围内，便于试验观察研究[17]。因此，选择400 μmol/L H2O2进行后续细胞损伤保护试验。

2.2 辣木叶不同极性部位对HepG2细胞存活率的影响

为了后续试验研究辣木叶对H2O2氧化损伤细胞的保护作用，样品剂量作用于正常细胞必须是安全无毒的。辣木叶不同极性部位对HepG2细胞存活率的影响见图2。

图2 辣木叶不同极性部位对HepG2细胞存活率的影响（24 h）Fig.2 Effect of different polar extracts of Moringa oleifera leaves on the survival rate of HepG2 cells（24 h）

由图2可知，在4个样品浓度均低于1.0 mg/mL时，细胞存活率都大于99%，因此选择0.1、0.5、1.0 mg/mL这3个剂量来研究H2O2导致HepG2细胞损伤的保护作用。

2.3 辣木叶不同极性部位对HepG2细胞损伤的保护作用

辣木叶不同极性部位对HepG2细胞存活率的影响见表1。

试验结果显示，模型组细胞存活率为（64.73±1.52）%，与正常组（99.81±0.41）%相比，存活率显著下降（P＜0.001），这说明细胞损伤成功。由表1可知，与模型组相比，除M4低浓度组外，其它样品低、中、高浓度组的细胞存活率均有明显升高（P＜0.01，P＜0.001），并具有浓度依赖性；浓度相同时，M2对H2O2损伤HepG2细胞的抑制作用最强，M3、M次之，M4最弱；高浓度时（1.0 mg/mL），预先用M2溶液处理HepG2细胞，400 μmol/L H2O2对细胞的损伤较小、存活率达到（92.24±3.22）%，比模型组提高了42%以上，防护作用显著（P＜0.001）。

表1 辣木叶不同极性部位对HepG2细胞存活率的影响（n=5）Table 1 Effect of different polar extracts of Moringa oleifera leaves on the survival rate of HepG2 cells（n=5）

2.4 辣木叶不同极性部位对H2O2导致HepG2损伤细胞酶活力的影响

辣木叶不同极性部位对HepG2损伤细胞酶活力的影响见表2。

由表2可知，与正常组比较，模型组中MDA的含量显著上升（P＜0.001），其它酶的活力显著下降（P＜0.001），说明经H2O2处理后细胞氧化损伤造模成功。与模型组比较，辣木叶样品组预处理后显著降低了细胞中 MDA 含量（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001），细胞内SOD、GSH-Px、CAT 活性显著升高（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001），并具有浓度依赖性，各样品组使各项指标均趋于正常组细胞的水平。说明辣木叶不同极性部位通过改变细胞内 SOD、GSH-Px、CAT活力，发挥了对HepG2细胞氧化损伤的预保护作用。综合比较各项指标，各样品其防护作用强弱顺序是：M2＞M3＞M＞M4。

表2 辣木叶不同极性部位对HepG2损伤细胞酶活力的影响（n=5）Table 2 Effect of different polar extracts of Moringa oleifera leaves on enzyme activity of HepG2 injured cells（n=5）

2.5 辣木叶不同极性部位对HepG2细胞抑制作用

辣木叶不同极性部位对HepG2细胞抑制率的影响见表3。

表3 辣木叶不同极性部位对HepG2细胞抑制率的影响（n=5）Table 3 The effect of different polar extracts of Moringa oleifera leaves on the inhibition rate of HepG2 cells（n=5）

由浓度筛选试验结果可知，辣木叶不同极性部位在作用时间较短（24 h）且浓度低于1.0 mg/mL时对细胞无抑制作用。由表3可得，辣木叶不同极性部位在浓度大于1.0 mg/mL时，对HepG2细胞的生长均有抑制作用，且呈浓度、时间依赖性；浓度及作用时间相同时，各极性部位对细胞抑制作用顺序为：M2＞M3＞M＞M4。综合考虑浓度和时间因素，M2的最佳浓度和作用时间分别是2.5 mg/mL、72 h，此时抑制率为（66.47±2.24）%，达到最大浓度时抑制率的87%，继续增大浓度对抑制率的影响较小。

辣木叶不同极性部位对HepG2细胞不同作用时间下的IC50值见表4。

表4 辣木叶不同极性部位对HepG2细胞增值抑制率的IC50值Table 4 IC50value of inhibition rate of different polar extracts of Moringa oleifera leaves on the proliferation of HepG2 cells

由表4可知，各样品对HepG2细胞的增殖抑制作用具有明显的时间依懒性；时间相同时，对HepG2细胞增殖抑制作用顺序为：M2＞M3＞M＞M4，与表3结果一致；作用72 h时，M4浓度是M2浓度的2.07倍以上才能达到相同的抑制效果。

3 结论

本试验采用H2O2诱导HepG2细胞氧化损伤探究辣木叶不同极性部位对细胞的保护作用，结果表明，利用较低浓度（＜1.0 mg/mL）的辣木叶不同极性部位预处理细胞后，对H2O2诱导HepG2细胞损伤具有明显的保护作用，其作用顺序为M2＞M3＞M＞M4，其作用机制可能与调节细胞抗氧化酶活性相关。增殖抑制试验结果表明，辣木叶不同极性部位对HepG2细胞增殖抑制作用与浓度和时间呈正相关，抑制作用顺序为M2＞M3＞M＞M4，该结果可能与辣木叶不同极性部位中总黄酮含量有关，但其作用机制尚需进一步研究。

综上，辣木叶乙酸乙酯部位（M2）在浓度较低时对细胞氧化损伤有较好的保护作用，但浓度较高时对肝癌HepG2细胞具有明显的抑制作用，其IC50值为1.83 mg/mL（72 h），显示了较强的生理活性，因而可进行后续的分离纯化和药效学研究。