正交试验优选铁力木花蕾总黄酮提取工艺*

马俊鹏，周美霞，李晓倩，王晓梅△，王新玲，胡君萍，依明·尕哈甫

（1.新疆维吾尔自治区人民医院，新疆 乌鲁木齐 830000； 2.新疆医科大学药学院，新疆 乌鲁木齐 830011）

铁力木MesuaferreaL.为藤黄科铁力木属常绿乔木，主要分布于印度、斯里兰卡及中国云南、广东、广西等地［1］。铁力木的树皮、叶子、花和果实均有药用价值，在民间主要用于治疗蛇毒咬伤、出血和脚部灼伤等［2］，具有抗炎、抗抑郁、抗肿瘤等多种药理活性［3-6］。铁力木花蕾作为新疆常用药材收录于《中华本草》等医药著作［7］，具有抗肿瘤、抗菌、抑制血小板聚集等作用［8-10］，主要化学成分有香豆素类、黄酮类、三萜类、莽草酸类等［11-14］。铁力木花蕾，且含有较丰富的黄酮类成分，不同极性部位的黄酮含量不同［15］。本研究中在单因素试验基础上采用正交试验优化了铁力木花蕾总黄酮的提取工艺。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

T6型紫外可见分光光度仪（北京普析通用仪器有限责任公司）；AB104-N型电子天平（梅特勒-托利多仪器＜上海＞有限公司）；EYELA N-1001型旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；KQ-700DV型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HH-S4型数显恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂）。

1.2 试药

芦丁对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号为B20771，纯度＞98%）；其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

1.3 药材

铁力木花蕾购自新疆维吾尔自治区维吾尔医医院药剂科，由新疆医科大学药学院王晓梅副教授鉴定为正品。将药材粉碎，过40目筛，备用。

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 溶液制备

对照品溶液：取芦丁对照品10 mg，精密称定，置25mL容量瓶中，以60%乙醇超声（功率100W，频率40 kHz）处理，并定容，即得质量浓度为0.4mg/mL的芦丁对照品溶液。

供试品溶液：取铁力木干燥花蕾粉末1 g，精密称定，置50 mL锥形瓶中，加60%乙醇30mL，回流提取2.0 h，提取3次。合并3次提取液，以60%乙醇定容至25mL，即得。

2.1.2 方法学考察

检测波长选择：取对照品溶液，在200～600 nm波长范围内扫描。结果芦丁在510 nm波长处有最大吸收，故选择510 nm作为测定波长。

线性关系考察：分别精密量取2.1.1溶液制备项下对照品溶液0.4，0.8，1.2，1.6，2.0mL，置10mL容量瓶中，加60%乙醇定容，摇匀，制成系列对照品溶液。精密量取上述系列对照品溶液适量，在选定波长处进样测定，记录吸光度（A），以芦丁质量浓度（C，μg/mL）为横坐标、A为纵坐标进行线性回归，得回归方程A=15.38C-0.028，r=0.999 0（n=5）。结果表明，芦丁质量浓度在0.01～0.08mg/mL范围内与吸光度线性关系良好。

精密度试验：取上述对照品溶液适量，在选定波长处测定6次，记录吸光度。结果芦丁吸光度的RSD为0.51%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液适量，分别于室温下放置0，2，4，8，10，12 h时在选定波长处测定，记录吸光度。结果总黄酮吸光度的RSD为2.55%（n=6），表明供试品溶液在室温放置12 h内基本稳定。

重复性试验：取样品适量，精密称定，按2.1.1溶液制备项下方法制备供试品溶液，在选定波长处测定6次，记录吸光度并计算含量。结果总黄酮含量平均值的RSD为1.96%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量样品适量，共9份，分别加入低、中、高质量浓度的对照品溶液，依法制备供试品溶液，在选定波长处测定，记录吸光度并计算回收率。结果见表1。

表1 芦丁加样回收试验结果（n=9）Tab.1 Resu lts of recovery tests（n=9）

2.2 含量测定和出膏率测定

取样品适量，分别依法制备供试品溶液，在选定波长处测定，平行测定3次，记录吸光度并计算样品含量。精密吸取供试品溶液适量，置蒸发皿中，蒸干，冷却后称定质量，计算出膏率。出膏率（%）=［（蒸发皿质量+浸膏质量）-蒸发皿质量］/药材质量×100%。

2.3 总黄酮测定方法权衡

采用综合评分法，设定药材中总黄酮含量的权重为0.7，出膏率的权重为0.3。综合评分（Y）=总黄酮含量×0.7+出膏率×0.3。

2.4 单因素试验

提取方法：取样品1 g，精密称定，分别以超声法、回流提取法提取总黄酮。结果超声法、回流提取法综合评分分别为45.72分，59.90分，故选择回流提取法。

提取溶剂：取样品1g，精密称定，置50mL圆底烧瓶中，分别加水及20%，40%，60%，80%，100%乙醇25mL，回流提取2.0 h。结果以60%乙醇提取时，总黄酮综合评分最高，故选择60%乙醇作提取溶剂。详见图1。

图1 提取溶剂筛选Fig.1 Selection of extraction solvent

提取时间：取样品1 g，精密称定，置50mL圆底烧瓶中，加60% 乙醇25 mL，分别回流提取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h。结果，回流提取2.0时，总黄酮综合评分最高，故选择提取2.0 h。详见图2。

图2 提取时间筛选Fig.2 Selection of extraction time

溶剂量：取样品1g，精密称定，置50mL圆底烧瓶中，分别加60%乙醇10，15，20，25mL，回流提取2.0 h。结果以25mL乙醇进行回流提取时，总黄酮综合评分最高，故选择溶剂量为25mL。详见图3。

图3 溶剂量筛选Fig.3 Selection of solvent amount

2.5 正交试验

根据单因素试验结果，以提取时间（A）、提取次数（B）、溶剂量（C）为考察因素，以浸膏得率为考察指标，采用L9（34）正交试验设计优选铁力木花蕾总黄酮提取工艺。因素与水平见表2，试验设计与结果见表3，方差分析结果见4。由表3、表4可知，铁力木花蕾总黄酮提取效率的影响大小依次为提取次数（B）＞溶剂量（C）＞提取时间（A），其中提取次数为主要影响因素，其次为溶剂量。故确定最优提取工艺为A1B3C3。

表2 L9（34）正交试验因素与水平表Tab.2 Factors and their levels

2.6 验证试验

取样品5.0 g，精密称定，依法制备供试品溶液，取适量，在选定波长处测定吸光度，并计算含量。结果样品中总黄酮的平均含量为221.97 mg/g，综合评分为155.49分，表明该提取工艺合理，结果见表5。

3 讨论

本研究中，采用单因素试验考察了铁力木花蕾总黄酮的提取方法、提取溶剂、提取时间、提取次数、溶剂量等因素，在此基础上，采用L9（34）正交试验设计优选铁力木花蕾总黄酮的提取工艺。结果显示，铁力木花蕾总黄酮提取效率的主要影响因素为提取次数，其次是提取溶剂量。按此最佳提取工艺得到的铁力木花蕾60%乙醇提取物中总黄酮含量较高，达221.97mg/g。表明该方法提取效率较高，同时操作简便，成本较低，可为铁力木花蕾的进一步开发利用提供可靠依据。

表3 L9（34）正交试验设计与结果（n=9）Tab.3 Design and results of L9（34）orthogonal test（n=9）

表4 方差分析结果Tab.4 Results of ANOVA

表5 验证试验结果Tab.5 Resu lts of verification test