枯否细胞在肝移植脂肪供肝的缺血再灌注损伤中的作用研究进展

蔡佳晖，王经琳，任昊桢，施晓雷，

（1.南京医科大学附属鼓楼临床医学院 普外科，2.南京大学医学院附属鼓楼医院 普外科，江苏 南京210008）

缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）是指缺血、缺氧的组织或器官在重新获得血液及氧气供应后，损害不但没有减轻，反而加重的病理生理过程。一般分为四个阶段：器官离开供体到冷冻前的热缺血期，冷藏器官以降低代谢率的冷缺血期，器官与肝移植患者进行血管重建的复温期，血流再通的再灌注期。肝脏IRI是肝移植的常见风险，影响手术的成功与否，也决定了移植后器官功能的恢复情况。

目前，肝移植患者的数量远超可用供肝的数量，诸如脂肪供肝这类边缘供肝的应用就愈发普遍[1]。然而，相较于正常供肝，脂肪供肝线粒体ATP生产能力下降[2]，这使其对IRI的耐受能力下降。同时，脂肪供肝内的细胞色素P450酶代谢多余的脂肪酸并生成大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），导致枯否细胞（Kupffer cells，KCs）对凋亡信号更为敏感，促进了脂肪供肝的细胞凋亡。细胞凋亡需要ATP，当ATP耗竭，凋亡转变为坏死，所以脂肪肝的特点是中度凋亡和大量坏死（73%），这种细胞死亡类型的改变或许增强了脂肪供肝对促炎因子的敏感性[3]。而在IRI过程中，经典活化的KCs将释放大量炎症介质，如肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β、IL-18、血小板活化因子（platelet activating facter，PAF）、不同的前列腺素、干扰素（interferon gamma IFN）等，对组织产生有害作用。这表明在IRI过程中，KCs对脂肪供肝有着重要的影响。

移植前，脂肪肝中的KCs 体积增大，数量增多，且处于激活状态[4]。当发生IRI时，KCs进一步激活，这与再灌注时大量内毒素（LPS）的涌入有关，也与肝内的氧化应激反应有关，由于KCs本身的细胞特性，还与其极化状态的改变有关，但具体机制尚未明确。

1 脂肪肝IRI的病理生理

随着现代人饮食结构的改变，高脂高热量饮食愈发普遍，这就导致非酒精性脂肪肝病（NAFLD）人数日益增多，在亚洲地区NAFLD的总体患病率为29.62%[5]。当肝脏发生脂肪变性，肝细胞内的脂滴使细胞胀大，一方面导致肝血窦腔隙减小，血流不足，肝细胞缺氧坏死，另一方面保存器官时易发生脂肪固结，引起再灌注时肝细胞崩解。脂肪变性也改变了线粒体膜的脂质组成和流动性，使其易受到自由基的攻击，同时，细胞器的主要抗氧化物质还原型谷胱甘肽（GSH）也发生下降。于是在IRI时，大量氧自由基生成，脂肪肝内脂质过氧化，氧自由基直接损伤细胞组成，或产生炎性因子和黏附分子造成间接损害。KCs的激活是脂肪肝IRI加剧的另一原因，这一点将在下文着重介绍。

2 KCs的基本形态

KCs是一种肝固有巨噬细胞，来源于骨髓中的单个核细胞[6]，占全身巨噬细胞总数的80%～90%，约占肝脏细胞总数的15%[7]。KCs体积较大，形态不规则，可伸出丝状伪足依附于肝血窦内皮细胞表面或经窗孔伸入Disse间隙内，与肝细胞微绒毛交错，这样的结构方便其协调或影响其他细胞的功能。KCs含有多种溶酶体酶，其质膜表面可表达多种受体，如Toll样受体（toll like receptor，TLR）、内毒素受体、清道夫受体、Fc受体、补体受体、半乳糖胺受体等。KCs的结构及酶学特点均表明其具备吞噬、分泌、免疫调节与监视的作用。在受到刺激后，KCs将释放大量细胞因子、趋化因子、炎症介质、活性氧中间产物和一些其他的因子[8]。

3 KCs的功能

KCs在多种肝脏疾病中发挥重要作用。发生急性肝衰竭时，损伤相关分子模式（DAMPs）释放，激活固有免疫，KCs通过释放炎症因子和趋化因子产生炎症环境；在NAFLD中，KCs被激活，TNF-α、IL等多种细胞因子，使NAFLD向非酒精性脂肪肝炎（NASH）进展；KCs与自然杀伤（NK）细胞相互作用可能是肝纤维化过程中的一个调控因素[9]，这对预防肝硬化有积极意义。

KCs在肝移植的IRI中也有重要作用。在肝脏IRI的热缺血期，由于肝脏处于相对缺氧状态，无氧酵解增多易引起代谢性酸中毒，同时ATP的减少导致细胞膜离子交换紊乱，在这些因素的影响下，细胞内钙离子浓度上升，形成钙超载。增多的钙离子，一方面使黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶，这一转变将加速氧自由基的产生，另一方面也激活了KCs，释放细胞因子损伤肝脏。此外，冷缺血期主要损害肝非实质性细胞，机制与热缺血期类似，在这一阶段，NF-κB受到应激，活性增强，使细胞因子基因表达增多[10]。在再灌注期，大量LPS随血流进入肝脏，与KCs表面受体结合，释放细胞因子，导致肝脏炎症反应[11]。显然，在整个肝移植IRI过程中，KCs都扮演着重要角色，因此，明确KCs的作用机制将有助于提高肝移植术后供体肝的存活率与功能。

4 KCs加重脂肪供肝IRI进程的机制

脂肪供肝一般来源于NAFLD患者，其肝脏内的KCs处于激活状态[4]，这是NAFLD发展为NASH的重要原因，也就是说相较于正常供肝，脂肪供肝本身的基础条件较差。当发生肝脏IRI，脂肪供肝内的KCs进一步激活，这可能与大量LPS的涌入、氧化应激反应以及极化状态的转变有关。

4.1 加重脂肪供肝IRI时KCs的激活与大量LPS的涌入有关

门静脉血中含有许多微生物相关抗原，主要为革兰氏阴性菌细胞壁成分LPS。正常情况下，外周静脉血中的LPS含量极低，无法测得，但在门静脉血中高达1.0 μg/L。在肝移植过程中，随着再灌注的开始，门静脉血流开放，KCs被进入肝脏的LPS进一步激活。KCs质膜表面可表达多种受体，LPS一方面与LPS受体CD14结合，激活KCs释放炎症介质，另一方面与TLR4结合，通过引起KCs内钙超载激活NF-κB[12]，大量释放炎性因子、氧自由基及趋化因子。正常肝脏内的KCs通过上调抗炎基因精氨酸酶1和IL-10来抑制LPS介导的炎症反应，实现LPS耐受，但当肝脏存在脂肪变性时，这种保护机制受到了损害[13]，所以在脂肪肝中，LPS涌入激活KCs后造成更重的炎症损伤。

LPS激活KCs分泌多种炎性因子，包括TNF-α、INF、IL等。TNF-α是主要的炎性因子之一，低水平的TNF-α是肝细胞生长分化与再生所必需的调节因子，而高水平的TNF-α主要诱导肝细胞的凋亡与坏死。正常状态下TNF-α可以调控细胞的增殖、炎症、凋亡等一系列病理生理过程；而在脂肪肝IRI中，大量释放的TNF-α则导致肝脏损伤。已有研究表明，TNF-α的水平与供肝的损伤程度呈正相关，高浓度TNF-α是LPS引起肝脏炎症反应以及肝细胞凋亡的主要原因[14]。IL在传递信息、激活调节免疫细胞及介导炎症反应中起重要作用，其中IL-1β、IL-18等促炎因子主要来源于NLRP3炎症小体。NLRP3被KCs激活后发生寡聚化并招募适配器蛋白，然后与caspase-1结合，形成炎症小体，导致caspase-1的裂解和活化，促进了IL-1β和IL-18的成熟和分泌[15]。INF是一种主要用于抗病毒的糖蛋白，同时也有免疫调节的作用，它与TNF-α以及IL-2、IL-12都能增强NK细胞活性，引起更强的移植物免疫排斥反应。所有这些细胞因子，除了介导炎症反应，还会导致细胞间黏附分子（intercellular adhesion molecule，ICAM）和内皮细胞黏附分子（endothelial cell adhesion molecule，ECAM）表达的上调，同时，血管内皮细胞产生了PAF[16]。因此，大量白细胞和血小板聚集于肝血窦区，引发“无复流”现象，使肝脏缺血缺氧，间接对肝脏造成了损害。

趋化因子是一类可溶性细胞因子，它作为趋化剂引导细胞，特别是免疫细胞的迁移[17]。KCs经LPS激活后产生的趋化因子CCL2（也称为MCP1）是肝内主要的促纤维化细胞，它可以聚集淋巴细胞和中性粒细胞浸润肝组织，释放蛋白水解酶，损伤内皮细胞和肝实质细胞。同时，大量细胞的聚集加剧了前文所述炎症因子引起的肝血窦区“无复流”现象，使得肝内血流灌注进一步减少，加重肝组织损伤[18]。

4.2 加重脂肪供肝IRI时KCs的激活与氧化应激有关

KCs的氧化应激是早期损伤的表现，此时KCs产生和释放活性氧（reactive oxygen species，ROS），包括超氧阴离子和过氧化氢，对肝脏造成急性损伤[19]。ROS一方面可以损伤呼吸链中的酶复合物，引起细胞凋亡，另一方面可以上调促炎因子，造成炎症损伤。当发生IRI时，由炎症小体介导的无菌性炎症反应过程被启动，其中NLRP3炎性小体发挥主要作用[20]，而KCs产生的大量ROS可通过各种途径激活NLRP3炎性小体，最终产生炎症反应。在脂肪供肝中，会产生更多的ROS，加重了肝脏IRI[21]。Yang等[22]认为，其中的机制可能与以下有关：（1）脂肪变性导致细胞体积增大，肝血窦减小，脂肪肝本就处在相对缺血缺氧的环境；（2）线粒体氧化不足，生成的ATP无法满足缺血再灌注过程中的能量需求，就会产生更多的ROS；（3）脂肪肝内KCs处于应激状态，非IRI状态下也会生成炎症因子。也有研究指出，脂肪供肝在IRI过程中线粒体损伤加重，线粒体氧化应激和脂质过氧化作用增加，除了ROS的增多，抗氧化防御机制也受到损害，因此受到更重损伤。

4.3 脂肪供肝IRI时KCs的激活与极化状态的转变有关

KCs有两种表型，M1型为经典激活型，参与机体炎症、防御反应，此时主要释放TNF-α等促炎因子；M2型为替代激活型，参与机体抗炎、修复作用，此时IL-10等抗炎因子显著增多。当环境发生改变，KCs诱导分化为不同表型，发挥不同的功能，在适当条件下两种表型还可相互转化[23]。正常状态KCs为M2型，当肝脏发生脂肪变性，分解出的一些促炎脂肪酸将募集单核细胞，并在脂肪组织内将其转化为M1型的KCs，在IRI过程中，TLR的激活以及ROS的产生，也会将KCs转化为M1型。所以在肝移植过程中，脂肪供肝内的KCs偏向M1型，其炎症反应也强于正常供肝[24]。

5 KCs减轻脂肪供肝IRI的机制

除了损伤作用，KCs对肝脏也存在着保护作用，前文提到替代激活的M2型KCs参与机体抗炎，并能修复组织，这主要通过产生一些生物活性物质或上调表达一些酶类来实现。M2型KCs可以产生抑制性细胞因子IL-10，使T细胞失功能或无功能，或是表达凋亡相关因子配体（FasL）和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL），引发T细胞凋亡，从而实现肝脏的免疫耐受[25]，这将减轻缺血再灌注损害后移植物的排斥反应。另外，KCs可以生成可诱导一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS），KCs激活iNOS后，促进了NO的生成。NO是一种重要的血管扩张剂，有研究证实NO因其抑制血小板聚集、扩张血管的功能，在肝的缺血再灌注损伤中发挥了保护作用[26]。同时，KCs会生成血红素加氧酶-1（hemeoxygenase-1，HO-1），主要分布于KCs的内质网与核周外模，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡以及抑制血小板聚集的作用[27]。Zeng 等[11]证明，HO-1增加后，大鼠血清中多种炎性因子的含量下降，从而减轻IRI。还有研究证明，外源性上调HO-1表达后，可以显著保护肥胖Zucker大鼠的脂肪化肝脏，减少脂肪肝IRI[28]。HO-1还可以通过降解血红素的产物CO来发挥保护作用。CO可以使KCs生成的TNF-α和IL-6减少，也可以下调因LPS激活KCs产生的炎症反应，这些都改善了肝脏IRI。

总的来说，LPS与KCs表面受体CD14及TLR4结合后激活NF-κB，一方面释放大量炎症因子，包括TNF-α、INF、IL-2、IL-12，在造成直接肝脏损伤的同时，导致ICAM与ECAM表达上调，造成间接肝脏损害；同时也生成更多的ROS，激活NLRP3炎症小体生成IL-1β和IL-18，引起炎症反应，加重肝脏IRI。另一方面释放IL-10及HO-1，HO-1还能生成CO，这些细胞因子都可以抑制炎症因子，减轻炎症反应；而其释放的iNOS可以生成血管扩张剂NO，对肝脏IRI也有缓解作用（图1）。

图1 LPS激活KCs引起双向作用：LPS与KCs表面受体CD14及TLR4结合后激活NF-κB，一方面释放大量炎症因子，包括TNF-α、INF、IL-2、IL-12，导致ICAM与ECAM表达上调；同时生成更多ROS，激活NLRP3炎症小体生成IL-1β和IL-18。另一方面释放抗炎因子，如IL-10、HO-1及iNOS，HO-1生成CO，iNOS生成NO。

6 小结

IRI是肝移植术后供体肝功能受损和失功能的重要原因，是多因子共同作用造成损伤的持续过程，KCs在其中起到重要作用。对于脂肪肝供肝，肝实质细胞脂肪变性及肝非实质细胞激活状态使其处在一个相对缺血缺氧且促炎的环境。所以当IRI发生，LPS涌入后激活KCs释放大量细胞因子，脂肪肝表现出更差的耐受力，而脂肪变性导致的氧化应激加剧以及KCs极化状态向促炎型改变也使脂肪肝在IRI中受到更重的损伤。除了损伤作用，KCs对肝脏也存在着保护作用，激活的M2型KCs参与机体抗炎，并能修复组织。当前，脂肪供肝在肝移植术中应用增多是无法逆转的趋势，研究如何减轻脂肪肝IRI具有重要意义，而KCs显然是一个重要的靶点。