合并隐匿性胰胆反流的胆囊结石电镜微观结构观察

张思淼，刘飞，刘波，祁春春，史力军，李婧伊，马跃峰，杨玉龙，刘文志

（大连大学附属中山医院，辽宁 大连 116001，1.胆石病微创外科，3.胃肠外科；2.同济大学附属东方医院胆石中心，上海 200120）

胆囊结石是一种常见病、多发病，其发病原因与多种因素有关，随着胆胰共同流出道理论的提出，隐匿性胰胆反流（occult pancreaticobiliary reflux，OPBR）被认为是胆囊结石形成的重要原因[1-2]。OPBR是指在正常胆胰管合流的情况下发生的胰液向胆管反流[3]。在良性胆囊疾病中，OPBR的发生率为25.8%～84.2%[4]，且83.5%的胆囊结石存在OPBR[5]。目前认为，胆汁淀粉酶是反映胰液向胆管反流的客观指标[6]，与胆囊结石的形成密切相关[7]。本研究从微观结构的角度推测胆囊结石形成过程，探索OPBR的成石机制，为临床防治胆囊结石提供参考依据。

1 资料和方法

1.1 一般资料

回顾性分析2018年9月至2020年5月大连大学附属中山医院胆石病微创外科行腹腔镜胆囊切除术（laparoscopic cholecystectomy，LC）治疗的139例胆囊结石患者临床资料，所有患者术前MRCP均显示胆胰管汇合部无解剖异常，血清淀粉酶正常。本研究获伦理委员会批准。

病例纳入标准：（1）血清淀粉酶正常；（2）MRCP显示胆胰管合流正常；（3）行LC治疗的胆囊结石患者。排除标准：（1）急慢性胰腺炎；（2）合并肝脏疾病（脂肪肝、肝炎、肝硬化、肝癌等）；（3）单纯泥沙样胆囊结石；（4）胆囊颈管内结石；（5）肝内胆管结石；（6）医源性操作导致Oddi括约肌异常或曾经接受过ERCP治疗（如曾行肠胆吻合术，内镜下十二指肠括约肌切开取石术或内镜下胰胆分流术）；（7）合并胆胰汇合部疾病以外的其他肝胆胰疾病（如肝胆部肿瘤、胆囊腺肌增生症、肝外胆管狭窄或扩张等）。

1.2 研究方法

1.2.1 胆汁及结石收集：经腹腔镜建立人工气腹，暴露胆囊三角后，在胆囊底部用穿刺针抽取胆囊胆汁5 mL，置入普通真空试管并在30 min内送检胆汁淀粉酶，测量胆汁淀粉酶水平，其余操作同LC常规。术后取出胆囊内的结石。

1.2.2 结石观察：用刀片切开结石，对结石横切面及表面进行清洁、固定、干燥后，用双面导电胶固定在电镜样品台上，在镀膜仪（英国Quorum公司Q150T溅射镀膜仪）中真空喷金镀膜后，通过扫描电镜（美国Quanta公司Quanta450型扫描电子显微镜）对结石横切面进行观察。

1.3 评价标准

（1）胆汁淀粉酶浓度升高：高于血清淀粉酶正常值上限（110 U/L）[8]。

（2）正常胰胆合流：MRCP显示主胰管与胆总管在十二指肠壁内汇合。

（3）隐匿性胰胆反流（OPBR）：MRCP显示为胰胆合流正常，血清淀粉酶正常，胆汁淀粉酶浓度＞110 U/L。

（4）胆囊结石微观特征：笔者团队在大连理工大学化工实验室帮助下，结合化工材料学的概念，对胆囊结石的微观结构特征制定如下评价标准。晶粒：构成结石晶体的大小、形态各异的小晶体。电镜下见板片状、颗粒状等。晶界：晶粒间的轮廓边界。晶粒堆砌相对紧密（图1）：微观晶体呈整块状或类整块状分布，周围可见大量类球形颗粒，再细分为两种：①整块状：晶粒排列致密规整融合成块，可见部分裂纹，不见晶粒及晶界（图1A）；②类整块状：晶粒间填充物增多，晶界不清，部分晶粒连接成块（图1B）。晶粒堆砌相对疏松（图2）：晶界清晰，晶粒间有较大空隙，填充物较少，只见少量类球形颗粒。

1.4 统计学分析

采用SPSS 23.0统计软件对数据进行分析处理。计量资料符合正态分布，以（±s）表示，组间比较用t检验；计数资料以[例（%）]表示，比较用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组基线资料比较

依据胆囊胆汁淀粉酶水平，将98例胆汁淀粉酶浓度升高者（＞110 U/L）作为OPBR组，41例胆汁淀粉酶浓度正常者作为对照组。两组年龄、性别、结石数量、吸烟史、饮酒史、高血压、糖尿病及冠状动脉粥样硬化性心脏病（以下简称冠心病）基线资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性（见表1）。

表1 两组基线资料比较

2.2 电镜下胆囊结石微观结构特征

两组结石晶粒堆砌相对紧密型和相对疏松型在两组中均存在，故对两组结石微观结构特征不作分组介绍。电镜下观察两组胆囊结石由大量形态、大小各异的晶粒堆砌而成，如板片状、颗粒状晶粒等，周围可见类球形颗粒。板片状晶粒可呈层状、放射状、条索状、不规则交错的疏松排列（图2A），甚至晶粒间通过某些填充物进而融合成整块状（图1A）或类整块状（图1B1、B2）。整块状堆砌呈现晶粒排列致密规整融合成块，可见部分裂纹，不见晶粒及晶界（图1A）；类整块状堆砌呈现晶粒间填充物增多，晶界不清，部分晶粒连接成块（图1B1、B2）。颗粒状晶粒呈疏松的类球形（图2B），甚至可见毛刺球形的类整块状分布（图1B3）。以上特征均在两组中出现。

图1 晶粒堆砌相对紧密型的胆囊结石微观结构

图2 晶粒堆砌相对疏松型的胆囊结石微观结构

2.3 两组电镜下结石微观结构比较

OPBR组98例中64例结石晶粒间填充物增多，微观晶体呈整块状或类整块状分布，周围见大量类球形颗粒，表现为相对紧密型；34例结石晶粒间填充物较少，有较大空隙，晶界清晰，周围只见少量类球形颗粒，表现为相对疏松型。对照组41例中18例呈相对紧密型，23例呈相对疏松型。OPBR组胆囊结石晶粒堆砌紧密程度较高，且结石为相对紧密型的比率高于对照组[65.3%（64/98）vs43.9%（18/41），χ2=5.474，P＜0.05]，差异有统计学意义。

3 讨论

胆囊结石具有晶体特征，是胆汁中多种成分在复杂因素影响下相互作用的结果。随着研究深入，学者们普遍认为胆囊结石是因某种因素打破胆汁中胆固醇、磷脂、胆汁酸三者之间浓度平衡，甚至破坏了促、抗成核因子的动态平衡，胆固醇聚集结晶，胆汁内出现晶核[9-11]，每个晶核在细菌、自由基、离子等众多复杂理化因素的影响下，逐渐成长为形态及大小各异的晶粒。本研究中，胆囊结石晶粒有板片状、颗粒状、针杆状等。乔铁等[12]发现，晶粒间的缝隙存在一定数量的类球形颗粒（为胆红素颗粒）。有研究表明，胆囊结石是由一定数量的晶粒通过非晶物质填充进而堆积而成[13]，此填充物主要由蛋白质和胆红素盐组成[14]。多数研究者认为，胆囊结石的晶体结构较疏松且易破坏，这是采用体外振波碎石的结构基础[15]。因此，我们大胆推测，因众多复杂病理因素致胆汁内促、抗成核因子等某些动态平衡被打破，胆汁中晶核出现，晶粒逐渐长出；胆囊内复杂多变的环境限制晶粒进一步生长，所以晶粒主要通过蛋白质网架及具有促成核作用的胆红素盐作为填充物，相对疏松地堆砌成多核生长的结石晶体。

本研究中，OPBR组中整块状或类整块状结构比率较对照组高，我们推测胰液中大多数酶是以酶原形式存在的，反流入胆管内的酶原被胆汁激活后可引起较严重的生化破坏，如：胆固醇酯水解酶及磷脂酶A2被激活后，可分别水解胆固醇酯和卵磷脂，其产物中均有脂肪酸，可与钙离子结合成脂肪酸钙盐，形成结石晶体的晶核[16]；同时，激活的磷脂酶A2在分解卵磷脂后可产生有细胞毒性的溶血磷脂酰胆碱，这使胆汁中卵磷脂、胆固醇及胆盐比例失衡，胆固醇溶解度降低而析出[17]。此外，这些激活的酶及其代谢产物可引起胆囊黏膜损伤并产生更严重的慢性炎症改变[18]，胆囊黏膜损伤影响其对水和离子的重吸收，使胆汁内黏蛋白及白蛋白等浓缩[19]，慢性的炎症刺激使胆囊黏膜上皮细胞分泌大量黏蛋白，这为胆固醇沉积提供了结石网架[20]。动物实验研究发现，取石后的胆囊黏膜分泌黏液增加，其黏液中糖蛋白先形成框架，使沉积其上的胆色素和胆固醇结晶成为微小结石，是取石术后复发的重要原因[21]。由此可见，OPBR可导致胆汁内黏蛋白的大量分泌与浓缩，作为促成核因子的胆红素钙盐聚集沉淀，两者正是胆囊结石晶粒间填充物的主要成分，它们共同构成结石晶粒堆砌的连接与网架。还有研究发现对于胆囊底部的微小结石和胆泥，可影响胆囊的收缩功能及其对胆道压力的调节，使胆道压力逐步降低[22]，且胆囊排出的微小结石及胆泥可间歇性阻塞胆胰共同流出道，从而加重高压的胰液反流入胆管[6]。胆囊结石与OPBR之间相互影响，促进结石形成与进一步生长。

胆道外科属于腔道外科，通畅与否是分析问题的原则。研究发现，由于胆胰隔膜缺失或Oddi括约肌功能失调，乳头炎等胆胰汇合部疾病随之发生[2]。此疾病可引起胆胰共同流出道不畅，高压的胰液反流至胆管，进而发生OPBR，且淤积的胆汁胰液使胆道压力升高。这一系列病理生理改变成为胆囊炎伴结石等多种胆道疾病发生的重要原因[23]。由此可见，胆道疾病多为胆胰汇合部疾病的表现形式[1]。由于胆胰共同通道过长为OPBR的独立危险因素[24]，目前对于存在胆胰汇合部疾病的OPBR患者，临床可经十二指肠镜行内镜下胰胆分流术（endoscopic pancreaticobiliary separation，EPBS）[25]，剖开乳头括约肌而非Oddi括约肌，维持胆道密闭性，通过缩短胆胰共同流出道来解除流出道梗阻[26]。EPBS可有效减少取石术后结石的复发，并降低胆囊切除术后综合征的发生率[2，6，27]。我们可通过扫描电镜观察被取出的结石，细化EPBS手术指征，对诊断OPBR、开展针对患者结石成因的个体化治疗具有重要辅助意义。

本研究将未行ERCP、EST、胆肠吻合等术式的胆囊结石患者作为研究对象，以排除肠胆反流对研究结果的影响。取样时发现，取出的胆汁含大量泥沙样结石的样本，通常胆汁淀粉酶浓度较高，病程较长。此发现与上述隐匿性胰胆反流成石机制相符。本研究中两组结石均出现晶粒堆砌相对紧密与疏松的结构特征，这可能与胆道压力、病程等其他尚不明确的因素有关，需逐步深入探索。OPBR组内，即使是排列疏松的晶粒，其边缘也大多可见絮状物附着，高度怀疑其主要成分是蛋白质，需进一步验证。目前研究表明，OPBR可表现为胆汁淀粉酶浓度升高和（或）胆道压力的升高[7]，关于胆道压力对结石微观形态的影响度仍需探索。若通过红外光谱从成分的角度探索合并OPBR的胆囊结石特征，能否进一步得到启发并验证或部分验证本研究的推测，仍需不断深入研究。

综上所述，当OPBR发生时，晶粒间填充物增多、胆囊结石与OPBR间相辅相成的恶性循环，使晶粒彼此聚集更加结实、紧密，进而使胆囊结石晶体呈整块状或类整块状分布。本研究分析结石微观结构，探索OPBR成石机制，可为胆胰汇合部疾病及取石术后结石复发提供理论依据，对临床通过EPBS等个体化治疗方式处理结石原发病有重要参考价值。此结果仍需结合红外光谱、X射线能谱、多中心、大样本及动物实验进一步研究证实。

致谢：衷心感谢大连理工大学化工学院王同华教授及其团队对本研究的技术支持与指导。