Rho/ROCK信号通路调控肝星状细胞活化的研究进展

辛鹏飞，高雪，康富贵，张琛涵，柴琛，张建刚

（兰州大学，1.第一临床医学院，2.基础医学院；3.兰州大学第一医院 普外科，甘肃 兰州 730000；4.苏州高新区人民医院 普外科，江苏 苏州 215100）

肝纤维化是大多数慢性肝病的主要结局，包括病毒性肝炎、酒精性脂肪性肝炎、代谢性疾病、药物毒素等，长期暴露于损伤环境可导致纤维化进展为不可逆转的肝硬化，虽然可以针对病因进行治疗，但我们仍然缺少抗纤维化治疗的有效手段。尤其近年来非酒精性脂肪性肝炎导致的肝纤维化更加普遍，因此研究肝纤维化的机制至关重要。研究表明肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）是体内肝纤维化的关键因素，与潜在的疾病无关[1]。在肝损伤过程中，HSCs由静止状态激活并转分化为增殖、收缩的肌成纤维细胞样表型，引起细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的过度沉积。异常的ECM也能通过Rho/ROCK（Rho associated coiled coil forming protein kinase，ROCK）信号通路刺激活化的HSCs迁移和增殖。在这篇综述中，我们总结了活化的HSCs与Rho/ROCK信号通路有关的研究成果，以期为抗纤维化治疗找到新的思路和方法。

1 HSCs的基本功能与活化

HSCs又称贮脂细胞或Ito细胞，是一种非实质细胞，在正常和损伤的肝脏中都有显著的功能，最初由von Kupffer于1876年发现，位于肝窦内皮细胞和肝细胞之间的Disse间隙内，其数量约占肝脏细胞总数的10%，它们最显著的特征是胞质核周脂滴的存在，这些脂滴富含视黄醇酯[2]。在正常肝脏中，HSCs保持静止、非增殖的表型，主要参与肝脏的稳态功能，包括发育和再生、免疫调节、维生素A代谢、细胞因子和生长因子的分泌、脂质代谢和药物解毒[3]。除了这些关键作用外，HSCs还协调一个复杂的细胞调控网络[4]。

在损伤或炎症性肝组织微环境中，多种细胞因子以及肝外因素均可直接或间接诱导HSCs活化，其激活方式具有独立性和特异性[5]。活化的HSCs转分化是肌成纤维细胞的主要细胞来源，是肝纤维化的中心环节[6]。自噬、内质网应激、氧化应激、脂质代谢和受体介导信号在内的多种途径揭示了HSCs活化的复杂性[5，7]。HSCs的活化过程大致可分为早期启动、后期持续2个阶段，是一个多细胞、多分子、多途径参与的过程[8]。如果HSCs的活化和增殖被抑制，或凋亡增加，则肝纤维化的进展可以被抑制或逆转[9]。功能研究表明多种信号通路和其他机制失调使HSCs永久活化，目前比较认同的是信号通路机制，HSCs的活化有多条信号通路调节，其中Rho/ROCK信号通路在HSCs活化、增殖及迁移过程中的作用已经受到广泛关注。

2 Rho/ROCK信号通路的功能机制

Rho/ROCK信号通路可以被多种细胞因子和炎症介质激活，包括血小板源性生长因子（PDGF）、内皮素-1（ET-1）、转化生长因子-β（TGF-β）等[10]。这些细胞因子和炎症介质是肝损伤和肝纤维化过程中产生的重要物质，在肝纤维化过程中均存在Rho/ROCK信号通路的关键分子的激活和表达，提示Rho/ROCK信号通路可能被炎症介质激活后参与肝纤维化的病理生理过程。Rho GTP酶和ROCK是Rho/ROCK通路的主要信号分子，Rho/ROCK信号通路激活后Rho与GTP结合形成Rho GTP酶，成为活化状态，将信号传递给下游效应分子ROCK使之激活，从而调控细胞的多种生物学行为[11]。

2.1 小G蛋白Rho家族及调节

Rho GTP酶家族是Ras超家族的成员，到目前为止已发现约20个成员，基于序列同源性和功能，被细分为5个亚家族[12]，Rho亚家族是其中之一。Rho蛋白存在于所有真核生物物种中，并且高度保守[13]。大多数Rho家族蛋白同Ras超家族的成员一样，在活性型（GTP结合态）和失活型（GDP结合态）构象之间循环，充当调节信号转导途径的分子开关[14]。在GTP结合态时能够与效应分子相互作用，启动下游反应，而内在的GTP酶活性使蛋白回到GDP结合态时，完成循环并终止信号转导过程。在哺乳动物细胞中，调节这个循环过程需要3类重要分子[15]：（1）鸟苷酸交换因子（guanine nucleotide exchanging factors，GEFs），是催化GDP释放和Rho与GTP结合，活化Rho GTP酶。（2）GTP酶活化蛋白（GTPase activating protein，GAP），作为负向调节因子加速Rho GTP酶的水解，使之由活性状态变为无活性状态；（3）GDP解离抑制因子（GDP dissociation inhibitor，GDI），能够阻止GDP从Rho GTP酶上分离，从而抑制酶的活性。

2.2 Rho/ROCK信号通路的激活

Rho GTP酶是真核细胞内一类重要的信号转导分子，是许多膜表面受体的下游效应蛋白，目前的研究发现Integrin受体家族、IgG受体超家族以及钙黏着蛋白受体家族等可以将多种细胞外信号包括可溶性信号分子（生长因子、细胞因子、各类激素等）、黏附接触、机械应力跨膜转导作用于Rho蛋白使其激活，调节不同的细胞反应[16]。Rho蛋白不仅能对来自上游不同受体所介导的信号作出反应，而且它们内部之间以及与其他小G蛋白家族如Ras之间相互影响，还可以作用于下游效应器，产生不同的生物学效应[17]。Rho GTP酶的下游靶点识别并不简单，因为大多数不包含可识别的保守域，目前已经报道了Rho家族成员的100多个靶点，包括大约30种激酶和很多支架/衔接蛋白[14]。ROCK属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，是最典型的Rho效应器之一，在各种细胞和生物学功能中起着核心作用[18]。ROCK分布于全身组织，主要存在两种亚型：ROKα（ROCK2）和p160 ROCK（ROKβ或ROCK1），ROCK1在非神经组织以及肝、肺、脾和睾丸中表达更高，而ROCK2在脑、心脏和肌肉中富集[19]。研究表明，ROCK1与应力纤维形成有关，而ROCK2在吞噬和细胞收缩中起关键作用[20]。

3 Rho/ROCK信号通路对HSCs活化的调控

Rho/ROCK信号通路可介导多种器官的间质纤维化，也是调节肝纤维化中HSCs活化增殖和收缩的主要信号通路。有研究表明RhoA在活化的HSCs中表达，并且Rho/ROCK信号通路调控HSCs活化相关的细胞形态改变[21]。ROCK是Rho下游关键效应分子，能接受Rho传递的信号，激活ROCK使多个氨基酸位点发生磷酸化，并介导下游一系列的磷酸化与脱磷酸化反应，产生多种细胞学效应，包括HSCs的收缩、迁移、增殖以及活化等[22]。

TGF-β和PDGF是促进HSCs活化和增殖的两种主要细胞因子。TGF-β1主要与膜特异性受体结合，通过SMADs蛋白（SMAD2和SMAD3）激活细胞内信号刺激靶基因的转录活性[23]。Rho/ROCK信号通路与PDGF、ET-1和TGF-β1/Smad等多条通路存在交汇，通过调节基因和蛋白的表达，在细胞增殖、迁移和凋亡等多种生理和病理过程中起关键作用[24]。TGF-β1是Rho/ROCK信号通路的上游激活因素，有研究表明，RhoA在TGF-β1诱导的HSCs迁移中起着关键作用[25]，采用不同浓度的TGF-β1刺激静息的HSCs，可检测到Rho/ROCK信号通路中RhoA和Cdc42的表达增加，HSCs表现为伪足及应力纤维增多，通过激光共聚焦显微镜观察到细胞迁移及骨架改变，进一步说明了TGF-β1激活Rho影响HSCs的活化和迁移。此外，还有研究证实了在人肝星状细胞株（LX-2）中TGF-β1激活ROCK和Smad通路，诱导TGFβ-2和ET-1的表达，从而促进HSCs活化和纤维化的进展[26]。PDGF是肝纤维化的主要参与者，介导HSCs增殖和ECM沉积[27]。内皮抑素通过调节Rho/ROCK信号通路抑制PDGF-BB或TGF-β1诱导的HSCs活化和增殖[10]。还有研究表明，局部粘着斑激酶（FAK）能通过Rho增强PDGF-BB诱导的HSCs迁移，证实了Rho/ROCK信号通路可能是HSCs迁移和增殖的关键途径[28]。

Rho/ROCK信号通路还可以激活整合素相关通路，整合素是一种细胞表面的跨膜糖蛋白受体，在介导细胞和ECM之间的相互作用和调节多种细胞功能中发挥重要作用。HSCs表达整合素α1β1、α2β1、αvβ1、αvβ3、α6β4等，用siRNA沉默αvβ3或阻断该受体的信号通路均可诱导HSCs凋亡[29-30]。有研究证实Ang II也能增强肝星状细胞系（LI90）中MCP-1和RhoA的mRNA表达水平，并诱导MCP-1的分泌，这表明Ang II至少部分是由Rho/ROCK信号通路介导HSCs产生MCP-1调节肝脏炎症[31]。张小兰等[32]研究也发现，Ang II可使MLC蛋白磷酸化水平发生变化，Ang II处理组Rock2、RhoA GTP、Rho GEF的mRNA表达水平均显著高于对照组，说明Ang II可通过ROCK介导不依赖Ca2+的通路诱导HSCs收缩。Rho、ROCK及其家族蛋白，包括Rac1可促进活性氧（ROS）的产生并增强HSCs的收缩性[33]。还有研究揭示了p75神经营养因子受体（p75NTR）在HSCs活化中的作用，并表明甲状腺激素通过增加p75NTR表达，激活Rho和诱导α-SMA等途径促进HSCs的活化[34]。

近年来，microRNAs（miRNAs）基于其在多个生化途径中的重要功能，在肝纤维化中的调节已经被广泛研究，特别是在HSCs中，认为miRNAs对细胞活化和转分化具有重要的调控作用[35-36]。研究发现在肝纤维化和体外培养激活过程中miRNA-125b在HSCs中上调，在HSCs中过表达miRNA-125b通过直接靶向作用于Stard13结构域增强RhoA活性，而miRNA-125b敲低则抑制RhoA激活，抑制RhoA或其下游分子可减弱miRNA-125b诱导的HSCs内α-SMA表达和细胞收缩[37]。此外，在HSCs活化过程中观察到自噬水平增加，抑制自噬会抑制HSCs的活化和增殖[38]。有研究表明在体外PDGF及其下游分子SHP2抑制自噬，刺激HSCs释放胞外囊泡（EVs），PDGF和SHP2通过调控mTOR（雷帕霉素靶蛋白）信号分子，激活ROCK1和抑制自噬来诱导微泡和外泌体的释放，从而促进HSCs的活化和迁移[39]。

4 Rho/ROCK通路抑制剂及其对HSCs的影响

Rho/ROCK信号通路与HSCs的各种反应密切相关，其激活可以促进HSCs活化，但应用Rho/ROCK信号通路抑制剂，可以抑制ROCK活化及其所介导的下游磷酸化反应，从而抑制HSCs活化。

Y-27632和法舒地尔是两种主要的小分子ROCK抑制剂，它们在研究中被广泛使用。研究表明在HSCs中Y-27632能抑制RhoA诱导的应力纤维的形成，还能抑制FAK和细胞外信号调节激酶的磷酸化阻断细胞迁移和增殖[40]。法舒地尔是Rho/ROCK通路的另一种特异性抑制剂，有研究表明在HSCs中法舒地尔抑制胶原蛋白的产生并且增强胶原酶活性，并抑制细胞伸展、应力纤维形成及细胞生长[41]。王玉珍等[42]研究也证实法舒地尔通过抑制Rho/ROCK信号通路对细胞骨架的调节作用，抑制HSCs的黏附、迁移和增殖。C3是一种Rho的抑制剂，在培养的HSCs中能增强组蛋白相关DNA片段和caspase 3活性，提示抑制Rho/ROCK通路可导致HSCs凋亡，减少肝纤维化的发生[22，43]。研究发现莪术醇和丹参素等中药及其提取物也能通过阻断Rho/ROCK信号通路抑制HSCs的增殖收缩，延缓肝纤维化的进展[21，44]。还有研究表明腺苷在HSCs中以诱导肌动蛋白应力纤维丢失的方式抑制Rho/ROCK信号通路，是Rho通路的生理抑制剂，具有包括抑制HSCs收缩在内的多种功能[45]。

考虑到Rho/ROCK通路的多效性，即使是选择性抑制剂也可能损害正常的细胞功能，因此新的抑制剂正在开发并在体内验证。通过载体将抑制剂靶向作用于HSCs能有效抑制肝纤维化，使用药物载体pPBMSA将抑制剂Y27632靶向作用于活化的HSCs可以阻止其迁移、收缩，该载体由小鼠血清白蛋白（MSA）共价偶联到PDGF蛋白识别部分（pPB）组成[46]。研究发现焦磷酸合成酶（GGPPS）的表达在小鼠纤维化肝脏的HSCs中显著增加，GGPPS通过Rho/ROCK通路介导HSCs活化，使用携带siRNA-GGPPS的维生素A耦合脂质体特异性敲低GGPPS降低了HSCs活化[47]。此外，维生素A耦合脂质体ROCK抑制剂抑制LX-2细胞的活化，导致α-SMA和TGF-β1显著降低[48]。

5 小结与展望

HSCs活化是肝纤维化的中心环节，多种细胞、介质和信号通路共同作用于HSCs活化、增殖和迁移的各个环节。我们对HSCs活化的研究正在扩展，特别是以前与HSCs生物学无关的分子和途径有可能成为关键角色，但它们对治疗策略的影响尚不清楚，通过探究HSCs的活化机制，针对关键的信号通路将是开发有效的治疗肝纤维化的新方法。Rho/ROCK信号通路通过调控HSCs活化、增殖、迁移与基质代谢参与了肝纤维化的形成，抑制Rho/ROCK通路可以抑制HSCs的活化，延缓肝纤维化的进展，为肝纤维化的治疗提供了理论基础和新的靶点，对进一步阐述肝纤维化的形成机制具有重要意义。总体而言，开发新疗法最可能的领域是纤维化的逆转，诱导活化的HSCs失活、衰老和凋亡可能是一种可行的方法，但肝纤维化是一个复杂的动态过程，HSCs的活化更是受到不同信号转导通路的调控，因此只针对一个信号通路可能不足以逆转纤维化。我们还需要更深入的研究HSCs的活化机制，将基础实验研究的成果转化为临床治疗纤维化的策略，为肝纤维化治疗提供更多行之有效的方法。