三江源区典型高寒草地丛枝菌根真菌多样性及构建机制

李聪聪，周亚星，谷强，杨明新，朱传鲁，彭子原，薛凯，赵新全，王艳芬，纪宝明，张静*

（1.北京林业大学草业与草原学院，北京100083；2.中国地质调查局西宁自然资源综合调查中心（原武警黄金第六支队），青海 西宁810021；3.中国科学院大学生命科学学院，北京100049；4.中国科学院大学资源与环境学院，北京100049；5.中国科学院西北高原生物研究所，青海 西宁810008）

揭示驱动群落构建的生态过程一直是生态学研究的核心问题之一［1］。生态位理论强调确定性过程的重要性，包括环境过滤和生物过滤，而中性理论则认为群落的构建主要是由随机过程或扩散限制决定的［2−3］。尽管这两种理论存在明显不同，但已被广泛用于解释生物群落多样性及其维持机制［4］。近年来，有关驱动微生物群落构建生态过程的研究备受关注，许多研究注重于解析不同生态过程对微生物群落空间格局的重要性，有的研究认为环境因素对微生物群落分布的影响大于随机过程［5−6］，也有研究认为扩散作用等随机过程对微生物群落构建起决定性作用［7］，越来越多的生态学家则认为自然条件下的微生物群落组成是扩散限制、环境过滤和物种相互作用的结果［4，8−9］，即由确定性过程和随机过程共同决定。目前有关生物群落构建机制缺乏一致性结论［10］，这将影响人们对生态系统稳定性与动态变化的认知。

土壤生物类群复杂多样，包括细菌、真菌、古菌及线虫等，它们作为生态系统的重要组分，在生物地球化学循环中发挥着非常重要的作用［11］。在所有的微生物中，丛枝菌根（arbuscular mycorrhizal，AM）真菌是一类重要的内生菌根类真菌，能与大约80%以上的陆生维管植物形成共生关系，是自然界中分布最广、功能最重要的一类菌根真菌［12−14］。AM 真菌是植物专性营养共生菌，宿主植物为其提供生存所需的碳水化合物，作为回报，它们则帮助宿主从土壤中获取N、P 等矿物质营养和水分，提高植物抗逆性［15−16］。此外，AM 真菌还能调节植物种内之间的竞争关系［17］、促进生态系统演替［18］、稳定土壤结构［19］、提高植物生产力以及增加土壤碳固持［20］等。因此，AM 真菌物种多样性及功能多样性已成为衡量生态系统可持续性的一项重要指标［16，21−22］，成为当今菌根学研究关注的一个重点。AM 真菌的生态功能很大程度上依赖于其物种组成，因此，理解AM 真菌群落的构建机制对于预测AM真菌在自然界中的生态功能十分重要。已有研究表明，确定性因素在AM 真菌群落构建中起关键作用，如土壤养分可利用性［23］、光照强度［24］、降水［25］、pH［26］以及宿主植物［27］。然而，也有研究表明随机过程，如扩散限制［26，28］对AM 真菌群落组成具有重要的影响。但是以上这些研究忽略了物种间亲缘关系对AM 真菌群落构建的影响。广泛应用于植物群落研究的谱系分析技术，不仅为研究AM 真菌群落构建提供了新思路，也强调了亲缘关系在群落构建中的重要性，为推断不同生态过程在驱动AM 真菌群落构建中的重要性提供了新方法。

青藏高原是我国重要的生态安全屏障和重要的草地畜牧业生产基地，其主要的高寒草地生态系统约占整个青藏高原总面积的66%［29−31］，主要包括高寒草甸、草原、荒漠和湿地。该地区最典型的生境特征为高海拔、日照多、气温低、日较差大、强辐射、生长季节短等，是陆地生态系统中典型的极端胁迫生境之一［32−36］。虽然生境条件恶劣，但是该地区生物资源丰富，这些生物的生存策略和维持机制已经成为生态学界最热门的问题之一［36−37］。作为对植物生长发育和土壤环境保护具有重要作用的一类有益微生物，AM 真菌在青藏高原地区的分布格局及驱动机制已得到广泛研究［25，38−39］，然而这些研究仍停留在描述性阶段，很少涉及机理探求。

本研究以三江源国家公园高寒荒漠、高寒草原、高寒草甸和高寒湿地4 种典型草地生态系统为研究对象，通过分析不同生态系统中AM 真菌群落的物种及谱系组成，并结合群落谱系分析方法，探究高寒草地生态系统中AM 真菌群落变化的关键驱动过程，以探明影响AM 真菌群落组成的各种因素以及预测生态系统的可持续性。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

本研究区域位于三江源国家公园，地处青藏高原腹地，是长江、黄河、澜沧江的发源地，素有“中华水塔”、“亚洲水塔”之称。该区域属于典型的高原大陆性气候，表现为冷热两季交替，干湿两季分明，年温差小，日温差大，日照时间长，辐射强烈，无四季区分的气候特征。牧草生长期不足3 个月，无绝对无霜期。三江源国家公园地处青藏高原高寒草甸区向高寒荒漠区的过渡区，从东南向西北分布着高山灌丛、高寒草甸、高寒草原、高寒荒漠以及沼泽湿地组成的高寒生态系统。土壤质地粗，以高山草甸土为主。

1.2 采样地点及方法

2017 年8 月，本研究选择高寒荒漠、草原、草甸和湿地4 种典型草地生态系统分别进行取样，其中高寒草甸（34°59′45″N，94°29′42″E，4370 m）和高寒湿地（34°59′36″N，94°29′20″E，4370 m）位于曲麻河乡附近，优势植物分别为小嵩草（Kobresia humilis）和藏嵩草（Kobresia tibetica）。高寒草原（35°01′14″N，97°18′57″E，4309 m）采样点位于玛多县，优势植物为紫花针茅（Stipa purpurea）。高寒荒漠（35°27′36″N，93°28′36″E，4460 m）采样点位于治多县可可西里自然保护区内。在高寒荒漠、草原和草甸3 个采样点，分别采用“十”字样线法，每隔10 m 设点，间隔采集13 个点。基于草地群落空间异质性特征分析，在高寒湿地每隔10 m 设点，间隔采集了10 个点。在每个点设置1 m×1 m 的样方，对植被组成、盖度和高度等进行调查统计，同时采集0～10 cm 表层土壤，过2 mm筛后分别风干和冷冻保存。

1.3 土壤理化指标测定

土壤pH 值用1∶2.5（w/v）的土水比，复合玻璃电极检测［40］。采用烘干法测定土壤含水量（soil water content，SWC）［40］。采用外加热重铬酸钾容量法［41］测定土壤有机碳（soil organic carbon，SOC）含量，采用凯氏定氮法［42］测定土壤全氮（soil total nitrogen，TN）。土壤可溶性有机碳（soil dissolved organic carbon，DOC）的测定则采用冷水浸提法（土水比为1∶5，震荡过夜），用TOC 分析仪（Liqui TOC II；Elementar Analysensysteme GmbH，Hanau，德国）进行测定［40］。NaHCO3浸提−钼锑抗比色法测土壤有效磷（soil available phosphorus，AP）［43］含量。NO3-N 和NH4-N 的测定采用2 mol·L−1KCl 浸提后经流动分析仪（TRAACS 2000）进行测定［40］，其中土壤有效氮（soil available nitrogen，AN）为NO3-N 和NH4-N 之和。

1.4 AM 真菌群落的分子分析

每个样品称取0.5 g 冻存的鲜土，采用MoBio Power Soil®DNA Isolation 试剂盒提取土壤总DNA。初提DNA 用ddH2O 稀释10 倍后用作巢式PCR 扩增的模板。第一轮PCR 的引物为GeoA2-AML2，采用25 μL 反应体系，其中包括模板2 μL，引物各1 μL（10 μmol·L−1），按照Taq PCR Kit（Tiangen Biotech）说明书进行PCR 反应。扩增程序为：94 ℃3 min，30×（94 ℃30 s，48 ℃1 min，72 ℃3 min），72 ℃10 min。第一次PCR 产物稀释100 倍之后作为第二次PCR 的模板，引物采用AMV4.5NF-AMDGR，采用50 μL 反应体系。扩增程序为：94 ℃3 min，35×（94 ℃45 s，53 ℃45 s，72 ℃45 s），72 ℃10 min。两次产物均采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR 产物经纯化后进行Illumina-Miseq 高通量测序。

对于得到的双端序列数据，首先利用FastQC 软件对序列的数量和质量进行评价，然后利用Perl 脚本进行前期质量控制，去掉3’端低质量碱基以及含N 的reads，滑窗50 平均质量低于20 且长度小于200 bp 的reads。利用Flash 将两端reads 进行拼接，overlap 最小长度设为20 bp，最大为250 bp，overlap 区允许最大错配率为0.1。随后对raw tags 进行过滤，条件为去掉平均质量小于25 的序列，barcode 允许错配最大为0，最大引物错配数为0，片段大小过滤在200 和300 bp 之间。按照97%相似性对拼接过滤后的clean tags 进行聚类，同时去除singleton OTU（operational taxonomic unit）和嵌合体。将挑选出的代表序列参考NCBI 和MaarjAM 在线数据库进行比对，条件设置为＞97% similarity，＞90% coverage 和＞200 BLAST score value，对每个OTU 进行物种注释。为进一步确定序列的分类，本试验基于N-J（neighbor joining）系统发育树的拓扑学结构，确保每条代表序列都能够被划分至相应的科和属。本研究所获得的代表序列提交至GenBank 中保存BioProject（ID：PRJNA630556）。

1.5 数据统计与分析

AM 真菌α 多样性通过计算97%序列相似性水平的OTU 数（丰富度）、Shannon−Wiener 指数和Faith 谱系多样性指数（phylogenetic diversity，PD）来表征。利用单因素方差分析和Tukey’s honestly 显著差异检验（P＜0.05）分析不同草地类型间AM 真菌α 多样性的差异。AM 真菌α 多样性指数与环境因子的相关性利用Pearson相关进行检验。利用非度量多维尺度分析（non-metric multidimensional scaling analysis，NMDS）对植物群落和AM 真菌群落进行排序分析，计算两两草地类型间群落组成的Bray-Curtis 相异性指数，组间群落组成的差异性用非参数的多元方差分析（permutational multivariate analysis of variance，PerMANOVA）来进行比较。

AM 真菌的谱系结构利用R 语言picante 包完成。评估一个群落的谱系结构与零假设的群落（及理论上完全由随机过程构建的群落）是否显著不同，本研究基于最近种间平均进化距离（mean nearest taxon distance，MNTD），利用“ses.mntd”函数计算了净最近种间亲缘关系指数（nearest taxon index，NTI）［44］。通过NTI 值可以推断随机过程和基于生态位机制的生态过程在驱动群落装配中的相对重要性。一般而言，当基于所有群落样本NTI 值的平均值显著＞0，表明群落在谱系结构上为聚集，＜0 为谱系发散，而与0 无显著差异则表明群落谱系结构是随机的。NTI 值和0 期望值之间的显著差异是由双尾单样本t检验（one-samplettest）在95%的置信水平上确定的。为表征AM 真菌群落的演替，本研究基于βMNTD 计算了βNTI，当βNTI＜−2 或＞+2 时，表示试验群落与零模型间存在显著差异，确定性过程（同质性选择及异质性选择）是推动群落演替的主导因素；反之，|βNTI|＜2 时，试验群落与零模型间无显著差异，随机扩散（同质性扩散及扩散限制）以及漂移、多样化是推动群落演替的主导因素［44−45］。

AM 真菌群落与植物和土壤环境因子之间的相关性通过Mantel test 确定。本研究利用方差分解分析（variation partition analysis，VPA）来评估不同草地类型间植物和土壤环境变量对AM 真菌群落构成影响的相对贡献，其中，用于方差分解分析只能是通过因子预选（冗余分析redundancy analysis）被证明与AM 真菌群落相关的因子。最后，本研究通过Amos 5.0 构建结构方程模型用以分析草地类型如何直接或间接地影响AM 真菌群落组成，其中植物群落和AM 真菌群落组成采用相应的PCA 一轴上的得分值来表征。该模型拟合度的参考标准是：chi-square/df＜2，P＞0.05；近似误差均方根（root mean square error of approximation，RMSEA）＜0.05；拟合优度指数（goodness of fit index，GFI）＞0.99［46］。

2 结果与分析

2.1 植物和土壤环境因子的变异性

在4 种草地类型之间，除土壤pH 之外，其他环境因子均表现出较强的变异性，其中土壤有机碳含量（SOC）、土壤含水量（SWC）、土壤全氮（TN）、有效氮（AN）含量和土壤有效氮磷比（N∶P）变异性均在60% 以上，其次是有效磷（AP）、可溶性有机碳（DOC）、全磷（TP）含量以及植物丰富度的变异性也都在20%以上（表1）。NMDS 排序分析表明，不同草地类型间植物群落组成均存在显著差异（F=31.74，P=0.001；图1）。

图1 不同草地类型间植物群落组成的NMDS 排序Fig.1 NMDS ordination of plant community composition（Bray-Curtis distance）among different grassland types

表1 植物和土壤环境因子的变异性Table 1 Variability of plant and soil environmental factors

2.2 AM 真菌多样性及群落组成

本研究共检测到379 个AM 真菌OTU，分别归属于10 个属，其中优势属为球囊霉属（Glomus）［47］，占所有序列数的44.08%，其次是多样孢囊霉属（Diversispora）（26.37%）和近明球囊霉属（Claroideoglomus）（25.12%）。AM 真菌各属的相对丰度在4 种草地类型间存在明显差异（图2A），其中球囊霉属在高寒荒漠、高寒草甸和高寒湿地的相对丰度均显著高于高寒草原，而多样孢囊霉属在高寒草原的相对丰度则显著高于另外3 种草地类型，高寒荒漠近明球囊霉属的相对丰度则显著低于另外3 种草地类型（图2B）。

图2 AM 真菌属水平上在各草地类型的相对丰度［48］Fig.2 Relative abundance of AM fungi in various grassland types at the level of genus

高寒湿地AM 真菌的OTU 丰富度和谱系多样性指数均显著低于其他3 种草地类型，Shannon−Wiener 指数在4 种草地类型间则无显著差异（表2）。与NMDS 排序分析结果一致（图3），非参数的多元方差分析（Per-MANOVA）表明AM 真菌群落物种组成（F=5.61，P=0.001）和谱系组成（F=4.69，P=0.001）在不同草地类型间均存在显著差异（表3）。

表2 不同草地类型间AM 真菌α 多样性指数的差异Table 2 Differences in α diversity index of AM fungi among different grassland types

图3 AM 真菌群落（A）物种组成（Bray-Curtis distance）和（B）谱系组成（Weighted-UniFrac）的NMDS 排序Fig.3 NMDS ordination of AM fungal community（A）species composition（Bray-Curtis distance）and（B）phylogenetic composition（Weighted-UniFrac）

谱系分析结果显示（图4），NTI［48］（最近亲缘指数）在4 种草地类型内均显著为正，表明在三江源地区典型高寒草地生态系统中，AM 真菌群落高度聚集。高寒荒漠的βNTI 均在−2 和+2 之间，而在高寒草原、高寒草甸和高寒湿地生态系统中，尽管大部分βNTI仍在−2 和+2 之间，但是在高寒草原（8.97%），βNTI＞2 的比例增加，而在高寒草甸（29.49%）和高寒湿地（22.22%），βNTI＜−2 的比例增加。

2.3 AM 真菌群落构成的影响因素

相关分析显示（表4），AM 真菌OTU 丰富度、香农−威纳指数以及谱系多样性指数均与土壤有效N∶P存在显著的负相关关系，OTU 丰富度和谱系多样性指数均与植物多样性（丰富度、香农−威纳指数）呈显著正相关，而与土壤含水量呈显著负相关。Mantel test 分析结果显示（表5），AM 真菌群落物种和谱系组成与土壤含水量的相关性最高，其次是土壤有效N∶P。植物多样性与AM 真菌物种组成显著相关，与AM 真菌群落谱系组成无显著相关关系。方差分解结果显示，地上植物群落组成、土壤含水量以及土壤有效N∶P 能够解释14%的AM 真菌群落物种组成（图5A）和31%的谱系组成（图5B）。其中，植物群落组成所解释的方差比例最大，其次是土壤含水量。

表3 不同草地类型间AM 真菌群落组成的PerMANOVA 分析［48］Table 3 PerMANOVA analysis of AM fungal community composition among different grassland types

图4 不同草地类型AM 真菌群落的NTI 和βNTIFig.4 NTI and βNTI of AM fungal communities in different grassland types

表4 AM 真菌α 多样性指数与环境因子的相关性Table 4 Correlation between α diversity index of AM fungi and environmental factors

表5 AM 真菌群落组成与环境因子的Mantel test 分析Table 5 Mantel test analysis of AM fungal community composition and environmental factors

结构方程模型（structural equation model，SEM）揭示了不同草地类型下AM 真菌群落构成的直接和间接影响途径（图6）。模型可解释54%的AM 真菌群落物种组成和33%的谱系组成的变化。整体来看，土壤含水量是AM 真菌群落物种组成的首要决定因素，其次是草地类型和植物群落组成的差异；而植物群落组成是决定AM 真菌群落谱系组成的关键因子，土壤含水量和土壤有效N∶P 则次之。

图5 植物群落组成、土壤含水量和土壤有效N∶P 对（A）AM 真菌群落物种组成及（B）谱系组成的贡献率Fig.5 Contribution rate of plant community composition，soil water content and soil available N∶P to（A）AM fungal virtual taxon composition and（B）phylogenetic composition

图6 草地类型、植物群落组成、土壤含水量和土壤有效N∶P 对AM 真菌群落物种组成和谱系组成影响的因果关系路径，以及每个因子对AM 真菌群落影响的标准化总效应系数（直接路径+间接路径）Fig.6 The structural equation model shows the causal path of the effects of grassland type，plant community composition，soil water content and soil available N∶P on AM fungal virtual taxon composition and phylogenetic composition，and the standardized total effect coefficient（direct path+indirect path）of each factor on AM fungal community

3 讨论

3.1 不同高寒草地生态系统中AM 真菌多样性的比较

本研究基于土壤DNA 分析，比较了三江源地区4 种典型高寒草地生态系统的AM 真菌多样性。研究发现，AM 真菌群落的物种组成和谱系组成在不同草地类型间均存在显著差异，其中，高寒荒漠、高寒草原和高寒草甸的AM 真菌多样性均高于高寒湿地。这说明相比于陆地生态系统，接近厌氧环境的湿地生态系统在很大程度上限制了AM 真菌的发育以及与湿地植物的共生［49］。与以往研究结果类似，适应性强、分布广泛的球囊霉属是本研究中高寒湿地的优势属，同时也是高寒荒漠和高寒草甸的优势属［50］。球囊霉科的AM 真菌能够通过它们的菌丝或者侵染的根段侵染新的宿主植物，比其他种类的AM 真菌有更高的繁殖速率和强度，因此，球囊霉属在很大程度上影响并决定了不同草地类型的AM 真菌的物种多样性。在4 种草地类型中，随着土壤含水量的增加，土壤碳、氮、磷等养分含量均呈现增加的趋势，土壤pH 值则呈现下降的趋势，与之对应的近明球囊霉属的相对丰度也呈现增加的趋势，并且与土壤养分指标均呈显著正相关，而与土壤pH 值则呈显著负相关。这说明水肥条件的改善更利于近明球囊霉属的生长发育。而在高寒草原生态系统中，多样孢囊霉属的相对丰度增加并成为该草地类型的优势属，这意味着以产大孢子、多菌丝为主的多样孢囊霉属在高寒草原的竞争能力更强，还是受到宿主特异性调控？这些问题需要进一步研究。

3.2 AM 真菌群落组成的驱动因素及相关生态过程

许多研究认为，植物多样性对AM 真菌群落的构建具有重要作用［27，51−52］。虽然本研究的对象是土壤内的AM真菌，而非植物根系，仍然检测到宿主植物能够显著影响AM 真菌的分布。本研究发现，AM 真菌物种丰富度和系统发育多样性均与植物多样性呈显著正相关，说明在自然生态系统中，多样性高的植物群落具有为AM 真菌提供更多样的生态位和栖息地的条件，从而增加了AM 真菌找到更合适的宿主植物的机会［53−55］。同时，本研究基于植物群落高度变异的分析，证实了在区域尺度上植物群落组成是AM 真菌群落空间分布最为重要的影响因素，说明植物更倾向将光合产物提供给能够为其生长提供更多帮助的AM 真菌类群［56］。然而，AM 真菌与植物之间的决定关系也并非一成不变，在共生体系的建立过程中，特定条件下AM 真菌及其宿主的功能特性在一定程度上决定了AM 真菌与宿主植物之间的相互选择，找到最适合的宿主植物可能是AM 真菌−植物协同进化的重要原因［57−58］。并且，AM 真菌物种之间存在明显的功能互补效应，丰富的AM 真菌种类可帮助植物更能充分地获取有限的养分资源，从而缓解植物之间的竞争，促进植物之间的共存［59−60］。此外，非菌根植物的存在（尤其是在湿地生态系统）也会在一定程度上抑制AM 真菌侵染植物根系，从而降低AM 真菌丰富度［61］。

本研究中，土壤水分和有效N∶P 是影响AM 真菌群落组成的另外两个关键因素，表明地下资源有效性对AM真菌具有重要的调控作用。土壤水分可直接影响AM 真菌侵染率［62］、根外菌丝的生长和分布［63］以及特定种的AM 真菌构建进而影响AM 真菌群落的构建［64］，同时，AM 真菌对氧气有相对较高的需求［65］，土壤的通气状况在很大程度上会影响AM 真菌的生长发育及其多样性，这也就解释了本研究在高含水量和可能缺氧的湿地生态系统中发现了较低的AM 真菌多样性。此外，如前所述，植物群落组成是影响AM 真菌的重要因素，而土壤水分变化可间接通过改变地上植物群落构成、多样性以及生产力等来影响AM 真菌［25，66−67］。地面植物群落从改变组成、多样性、生产力等方面影响AM 真菌。除水分外，土壤氮磷资源均是植物及其共生AM 真菌的必须矿质元素，土壤氮磷养分水平和氮磷的化学计量比决定了AM 真菌与植物的共生关系［68−69］。低水平的氮磷有效性是AM 真菌−植物互惠共生关系的重要前提，但是过低/高的氮磷水平又会直接限制AM 真菌的生长，当氮和磷均不是限制因子时，AM 真菌与植物竞争光合产物，又会抑制植物生长［70］。本研究中，土壤有效氮磷化学计量比与AM 真菌多样性呈显著负相关，尤其对AM 真菌群落的谱系组成影响更大，暗示了土壤氮磷的平衡性可能对AM 真菌群落构建有着重要作用。而且土壤N、P 资源的可利用性对植物的生长发育、物种多样性和群落结构等均具有显著的调控作用［23，68，70−71］，这些变化也会引起AM 真菌群落结构和功能变化。

本研究中AM 真菌群落在4 种高寒草地生态系统中均为谱系聚集模式，表明在自然生态系统中AM 真菌物种间的亲缘关系均较近［24，72］。基于βNTI 结果则发现，随机过程（同质性扩散）是决定高寒荒漠生态系统AM 真菌群落构建的主要过程，而在另外3 种草地类型中，AM 真菌群落构建均以随机过程为主导、伴随确定性过程微弱的影响。并且高寒草原的植物群落和土壤环境条件异质性比较大（斑块化），AM 真菌群落间的差异逐渐增大，受环境异质性选择的主导。而对于高寒草甸和高寒湿地，植物和土壤环境条件相对均匀，AM 真菌群落间的差异逐渐缩小，受环境同质性选择主导。

4 结论

综上所述，基于Illumina-Miseq 高通量测序手段，本研究揭示了青藏高原高寒草地生态系统AM 真菌多样性和群落组成及其相关生态过程。AM 真菌多样性和群落结构在4 种草地类型间存在明显差异，其中植物群落组成、土壤含水量和有效N∶P 是关键的影响因子。AM 真菌群落的谱系结构均为聚集模式，在高寒荒漠，AM 真菌群落构建由随机过程决定，而在高寒草原、高寒草甸和高寒湿地，AM 真菌群落受随机过程以及微弱的环境选择作用主导。