丹酚酸B对神经退行性疾病的保护作用研究进展

南亚强，陶计委，周 杰

神经退行性疾病是一类与遗传、年龄、免疫及环境等多因素相关的大脑及脊髓神经元慢性、不可逆性变性丢失的神经系统疾病，包括阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)、帕金森病(Parkinson's disease, PD)、多发性硬化症(Multiple sclerosis, MS)、亨廷顿病(Huntington disease, HT)以及脊髓侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis， ALS)等，其神经病理涉及遗传变异、衰老、氧化应激、神经炎症免疫、病理蛋白异常聚集、线粒体功能障碍、细胞凋亡及自噬异常等多种复杂机制[1]。近年研究发现肠道微生物也参与了神经退行性疾病的发生发展[2]。神经退行性疾病共同的结局为中枢神经元的致死性变性，导致运动及认知功能障碍，严重降低了患者的生存质量，给家庭及社会带来了较大负担。现阶段对神经退行性疾病的治疗措施大多针对某单一靶点，治疗效果不佳，基于其复杂的病因机制，近年来从传统中药中寻找新的具有多靶点效应药物防治神经退行性疾病越来越受到关注。丹酚酸B是传统中药丹参中含量最高的生物活性成分，具有抗氧化活性、抗炎、抗肿瘤、抑菌、抗病毒、抗纤维化及抑制血小板聚集等多种生物活性，对AD、PD、MS等神经退行性疾病具有有效的神经保护作用[3]。本研究就丹酚酸B对神经退行性疾病的神经保护作用机制的研究进行综述。

1 概述

丹酚酸B源于传统中药材唇形科鼠尾草属丹参的干燥根茎，由3分子丹参素及1分子咖啡酸组成，分子式为C36H30O16，分子量为718.62，热稳定性差、吸湿性强、可溶于水、呈白色粉末状[4]。丹酚酸B生物毒性低，因富含酚羟基团和电离出H+而具有抗氧化活性，其抗氧化活性强于天然抗氧化物维生素C、银杏叶提取物等物质，可通过血脑屏障，能有效地修复血脑屏障损伤，抑制细胞内Ca+超载、自由基过度生成，促进神经发生、血管再生，促使抗氧化物质生成，改善线粒体能量供应，临床中被用于治疗心脑血管疾病[5]，《中国药典》将其作为鉴定丹参品质的主要依据。蛋白质相互作用网络基因本体功能富集分析显示丹酚酸B通过调控细胞信号转导、细胞通讯、细胞代谢、细胞增殖及凋亡等细胞病理生理过程发挥生物活性效应[6]，从而对神经细胞、心肌细胞、肺泡上皮细胞、肝细胞、肾小管上皮细胞、血管内皮细胞及骨细胞等多个系统组织的细胞具有保护作用,研究证实丹酚酸B对AD、PD、MS等神经退行性疾病的病理改变有显著的缓解作用[7]。

2 对神经退行性疾病的神经保护作用机制

2.1抑制病理蛋白异常聚集 β-淀粉样蛋白(Aβ)、α-突触核蛋白(α-Syn)的异常累积及清除障碍是AD、PD的典型病理特征，Aβ、α-Syn均可通过触发氧化应激、损伤线粒体、激活神经胶质细胞、干扰大脑葡萄糖代谢、扰乱钙离子稳态以及诱导神经元凋亡等多种途径导致神经元发生变性死亡。AD病理相关的β分解蛋白1(BACE1)分解淀粉样前体蛋白(APP)生成可溶性淀粉前体(sAPPβ),sAPPβ由γ分解酶分解成Aβ肽段，可溶性Aβ肽段聚集形成的多聚物是导致AD认知功能障碍的重要因素。PD的α-Syn病理不仅存在于中枢神经系统，在肠道黏膜、唾液腺及皮肤等外周组织中同样被检测到，并以类似朊病毒样方式在神经元之间传播，诱导异常突触核蛋白单体的错误折叠和聚集，产生神经毒性损伤[8]。丹酚酸B可抑制Aβ、α-Syn的形成，并可增强机体对这些异常蛋白的清除能力。Tang等[9]构建过表达APP的人神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y)研究发现，丹酚酸B可通过抑制糖原合成酶激酶3(GSK-3β)的丝氨酸9位点磷酸化而抑制BACE1的活性及其表达，从而降低了sAPPβ水平，减少了Aβ40、Aβ42亚型生成。另有研究报道，丹酚酸B在无显著毒性的情况下可在表达APP的不同类型神经细胞及非神经细胞株中发挥调节BACE1活性及显著降低Aβ40、Aβ42水平的作用，而且在不影响γ分泌酶活性的情况下逆转Aβ生成发挥正性调节作用[10]。BACE1在大脑中高表达，是Aβ生成的重要限速酶，因此针对BACE1是治疗AD的重要靶点之一，同样，抑制α-Syn的形成及促进其清除也是治疗PD的关键环节。丹酚酸B可抑制α-Syn原纤维的形成并能减轻其神经毒性，不仅可降低磷酸化的不溶性α-Syn水平下降，而且可以与α-Syn单体结合抑制原代神经元细胞内的α-Syn聚集[11]。Wu等[12]在PD的细胞及动物模型研究中也观察到了丹酚酸B对α-Syn形成及聚集的抑制作用，并且发现丹酚酸B可通过增强分子伴侣介导的自噬作用促进细胞内溶酶体对α-Syn聚集体的降解。丹酚酸B有效抑制和清除AD、PD相关的异常蛋白生物效应可能与其具有较强的清除自由基功能密切相关，也不排除某个结构域可能与这些病理蛋白形成过程中的关键分子存在相应的结合部位。

2.2抗氧化 活性氧(ROS)、活性氮(RNS)在细胞的发生、分化、发育、成熟及衰老过程中有双重效应。适量ROS是调控细胞内氧化还原信号、驱动组织细胞修复的关键因子，环境毒素、机体衰老等促使细胞产生过量ROS可导致细胞内氧化与抗氧化稳态失衡、氧化还原性信号控制通路中断，造成组织细胞的DNA、RNA、蛋白质、脂类等重要分子丧失功能[13]，而大脑高耗能、高耗氧的代谢特性以及富含不饱和脂质、自身抗氧化能力弱等内在因素使得神经元及神经胶质细胞更容易遭受氧化应激损伤，因此，抑制和清除自由基是缓解细胞氧化应激的直接方法。丹酚酸B作为天然抗氧化剂在神经系统中可抑制和清除自由基，抑制催化ROS、RNS生成的一氧化氮合酶(NOS)、NADPH氧化酶(Noxs)等氧化酶活性，增强超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化酶活性，并促进胆绿素及胆红素等内源性抗氧化剂的生成[14-15]。He等[16]用Aβ诱导原代培养的小鼠神经元建立AD的体外细胞模型，研究指出丹酚酸B通过抑制ROS的生成、线粒体的脂质过氧化以及促进谷胱甘肽(GSH)生成而缓解了Aβ介导神经元的氧化应激损伤，减少了神经元突触的变性丢失。另一项研究采用SH-SY5构建PD的细胞模型，体外实验研究发现用丹酚酸B预处理SH-SY5Y细胞，可显著减少6-羟多巴胺(6-OHDA)诱导的ROS生成，明显增强了细胞活性[17]。

丹酚酸B还可调控一些抗氧化通路的信号转导而发挥抗氧化作用。Nrf2/ARE、NF-κB/IκB、PI3K/Akt等信号通路的激活与氧化应激损伤密切相关，其中Nrf2/ARE信号通路是机体细胞维持氧化还原稳态、防御氧化应激损伤和抑制炎症反应的重要途径之一[18]。Nrf2作为一种核转录因子可上调内源性抗氧化剂及一些修复酶相关基因的表达，同时参与正性或负性调节p62、PKC、PI3K/Akt/GSK-3β、NF-κB和p38 MAPK等信号通路，调节Nrf2相关通路是预防或减缓AD、PD等神经退行性疾病的潜在治疗靶点[19]。Zhou等[20]在PD模型的体内外研究中证实，丹酚酸B可促进神经胶质细胞质内Nrf2向细胞核转位，对多巴胺能神经元具有保护作用，并可改善PD动物模型的运动功能障碍，由此我们可以推测丹酚酸B对PD的神经保护作用可能基于激活Nrf2/ARE抗氧化相关通路，通过调节Nrf2的质核穿梭可能在细胞核层面发挥神经保护作用。

2.3保护线粒体 线粒体是细胞的能量来源，中枢神经过量ROS与氧化应激相互促进的恶性循环损伤、慢性神经炎症等引起的线粒体氧化磷酸化功能异常以及损伤后线粒体未折叠蛋白反应(UPRmt)的异常或延迟激活是神经元功能丧失的重要原因[21]。Aβ是内源性自由基产生的强诱导剂，可引起Tau蛋白过磷酸化，促使线粒体功能异常，另外，线粒体分裂相关动力样蛋白1(Dlp1)过表达以及糖原合成酶激酶3(GSK-3β)活性增强均促进Tau蛋白过度磷酸化，最终导致AD的线粒体功能障碍，引起神经元凋亡、变性、死亡。抑制或清除ROS、Aβ内生、Tau蛋白过磷酸化及Dlp1的过表达是恢复并维持线粒体功能的重要途径。丹酚酸B可恢复和维持AD病理相关的线粒体膜电位，促进ATP的生成以及修复细胞色素C氧化酶和F1Fo ATP合酶的酶活性，抑制神经元线粒体Dlp1的表达及过磷酸化[16]。杨军岭和杨侠[22]用1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导PC12细胞建立PD的细胞模型研究发现，丹酚酸B可缓解细胞受毒性损伤后的线粒体膜低电位情况，缓解ATP的合成功能障碍，维持线粒体DNA水平及线粒体发生相关基因的表达，并可促进受损后线粒体融合相关蛋白Opa-1和Mfn-1的表达，抑制线粒体分裂相关蛋白Drp-1和Fis-1的表达。表明丹酚酸B可通过抑制和清除自由基、抑制蛋白异常聚集及调控相关酶的活性、稳定线粒体功能等多种途径在线粒体功能修复方面发挥良好的生物效应。

2.4控制神经炎症 炎症是神经退行性疾病病理发生发展的主要驱动因素，包括AD、PD、MS、HT、ALS等神经退行性疾病均与慢性炎症相关。大量神经病理研究，证实小胶质细胞的激活在神经退行性疾病的炎症反应病理机制中起着十分重要的作用。慢性神经炎症不仅长期反复激活小胶质细胞和星形胶质细胞，促使胶质细胞持续释放炎性介质，而且可触发中枢神经发生氧化应激反应，而过量的ROS及RNS可反过来活化小胶质细胞、星形胶质细胞和外周免疫细胞CD4+T细胞等[22]，进一步加剧了组织细胞的炎性损伤。丹酚酸B可调控TLR4/NF-κB信号通路缓解脂多糖诱导单核巨噬细胞产生的炎症反应，通过下调TLR4、p-p65、p-IκBα的表达，进而抑制白介素-1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等炎性因子的生成[23]。Zhou等[20]研究报道，丹酚酸B在体内、外可通过激活Nrf2/ARE抗氧化信号通路对PD相关模型的神经炎症损伤起双重保护作用，一方面，丹酚酸B可通过上调Nrf2表达而缓解小胶质细胞活化，并抑制小胶质细胞产生TNF-α、IL-1β、一氧化氮(NO)等炎性介质而控制神经炎症；另一方面，丹酚酸B可促进星形胶质细胞分泌具有神经保护作用的胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)。由于Nrf2在调节炎症反应、细胞能量代谢、铁代谢、蛋白质稳态及线粒体生物能学等相关的基因表达方面发挥多种作用，探索丹酚酸B对Nrf2相关通路调节作用对抑制神经退行性疾病的神经炎症的发生发展有重要意义。上述研究提示，Nrf2与NF-κB信号通路交互作用是神经退行性疾病氧化应激与神经炎症发生的重要环节，更重要的是关于丹酚酸B对Nrf2与NF-κB调控机制的研究从控制神经胶质细胞活化减轻神经炎症角度为PD等神经退行性疾病的治疗提供了新策略。

2.5调节免疫 先天性免疫和适应免疫不同程度的参与了AD、PD、MS的起病，机体免疫与炎症息息相关。CD4+T细胞在神经元的变性过程中扮演着重要的角色，可分化为具有促炎效应的Th1和Th17两种细胞表型，同时可形成具有抗炎效应的Th2和调节性T细胞(Treg)。Th1和Th17介导的神经元发生免疫炎症性的脱髓鞘病理在MS中具有特征性表现，Th1不仅可活化小胶质细胞而且可激活星形胶质细胞，Th17主要对星形胶质细胞的活化起主要作用，目前MS的疾病修饰治疗主要依赖于调节免疫系统[24]。早期动物研究显示丹酚酸B具有抗疲劳及调节免疫的功能[25]。Dong等[26]采用小鼠构建实验性自身免疫性脑脊髓炎作为多发性硬化的动物模型，丹酚酸B治疗后实验动物的临床评分明显改善，中枢神经系统炎性细胞的浸润明显下降，有效且特异性地抑制了Th1、Th17细胞的反应。该研究表明丹酚酸B可能通过有效抑制神经损伤病理中的Th1细胞反应参与抗炎及调节免疫作用，有望成为MS/EAE患者的一种有效的治疗剂。

2.6抗细胞凋亡 神经退行性疾病神经病理的最终结果是神经元的死亡，其形式主要有凋亡、坏死、自噬。近年研究发现，细胞铁死亡是区别于前三种经典细胞死亡方式的另一种新的程序性死亡类型，与神经退行性疾病的病理性细胞凋亡也密切相关。研究证实神经退行性疾病患者的神经元大多数表现出凋亡的形态学特征和促凋亡因子高表达状态，许多信号分子与神经元的凋亡相关，包括促凋亡的casepase家族、Bax、Bad、Fas、Par-4、p53、谷氨酸受体样蛋白，以及抗凋亡相关的Bcl-2、Bcl-XL、凋亡抑制因子、端粒酶、蛋白激酶C、抗氧化酶和钙结合蛋白[27]。中枢神经组织细胞的再生能力非常有限，所以限制神经元的死亡是治疗神经退行性疾病的关键。Tian等[17]研究表明，丹酚酸B在抑制ROS生成的同时可通过抑制caspase-3活性、降低细胞色素C从线粒体向细胞的转位、下调Bax/Bcl-2比值等方式抑制6-OHDA诱导的细胞凋亡。Zeng等[28]随后用MPP+诱导SH-SY5Y构建PD的体外模型，同样发现丹酚酸B恢复了毒性损伤后的细胞活力，恢复了线粒体功能，抑制了ROS含量的增高，并发现其可抑制细胞色素C的释放和caspase-3的活化，显著降低了促凋亡因子Bax水平，降低了Bax/Bcl-2 mRNA含量的比值,显著抑制了细胞凋亡。

2.7促进神经元分化增殖 针对神经退行性疾病是由于神经元变性退化及出现功能障碍导致的，采用神经细胞移植治疗一直是相关领域研究的前沿和热点，伴随着将人体自身成熟细胞转化为诱导多能干细胞(iPSC)技术日趋成熟，iPSC应用有望为神经退行性疾病治疗带来希望。研究发现，iPSC可诱导为神经元和神经胶质细胞，其分化为具有中脑特征的多巴胺神经元经移植后可整合在PD模型宿主大脑并能改善PD模型行为[29]。然而，iPSC的神经分化速度在现阶段的技术情况下限制了其实用性。Shu等[30]研究发现在iPSC神经分化过程中加入丹酚酸B可显著促进iPSC向神经干细胞分化，并可进一步促进神经干细胞向神经元的分化和增殖，其机制可能是丹酚酸B激活AKT/GSK3β信号相关通路。丹酚酸B促进iPSC及神经干细胞的增殖分化效应为细胞移植治疗神经退行性疾病带来了新的转机。

2.8调节肠道微生物 肠道微生物稳态紊乱与PD、AD以及MS等神经退行性疾病密切相关，衰老过程对机体肠道微生物组成和功能具有显著影响，而肠道微生物与大脑通过多种途径存在生物信息双向交流，肠道微生物及其代谢产物在神经发生、神经免疫及神经内分泌等方面起着至关重要的作用，因此肠道微生物的构成、丰度及多样性改变可能是PD等神经退行性疾病发生发展的重要推手[31]，基于一些特定基因的缺失或功能障碍，肠道微生物的感染导致的免疫功能异常可能是引发PD多巴胺能神经元变性的扳机[32]。赵孟浩等[33]对PD模型小鼠经灌胃方式给予不同剂量的丹酚酸B治疗后，检测血液及不同脏器组织中丙二醛(MDA)、GSH含量，提取肠道菌群基因组进行高通量二代测序分析菌群差异，结果显示丹酚酸B可明显降低血清中MDA水平，并影响肠道菌群多样性及丰度，提高了具有抗炎、抑制脂多糖生成的菌群丰度。另外该项研究显示，丹酚酸B显著提高了具有抗炎作用的狄氏副拟杆菌丰度，而另一项临床配对比较研究显示MS人群的肠道中狄氏副拟杆菌丰度明显低于健康对照人群，体外实验研究显示狄氏副拟杆菌可刺激Treg细胞表达抗炎因子IL-10，从而发挥免疫调节和抗炎作用[34],由此我们推断丹酚酸B可能有通过调节肠道微生物而缓解MS病理的作用。表明丹酚酸B对肠道微生物的组成及丰度有影响，具体是通过丹酚酸B对肠道微生物群的直接影响还是其在肠道内的次级代谢产物产生的效应需要进一步明确；另外，丹酚酸B是否具有抑制某些对机体有害的微生物代谢产物的生成也值得进一步研究。

3 总结与展望

丹酚酸B多途径、多靶点的生物活性在防治心脑血管疾病同时对肺、肝、肾等相关疾病的治疗中也存在良好的疗效，针对老年患者衰老状态存在多脏器功能减退及功能障碍的情况，未来丹酚酸B在临床的开发应用更符合对神经退行性疾病等与衰老相关疾病的“全面论治”的临床治疗需要。近年来关于肠道微生物与机体慢性疾病之间的联系研究证据逐渐确凿，尤其是AD、PD等与微生物-脑-肠轴的关系争论激烈，新的研究显示丹酚酸B的体内抗氧化性可影响肠道微生物菌群，其结果是否与其抑制病理蛋白异常聚集、抗氧化、抗神经炎症及抗凋亡功能有关还需进一步探究；丹酚酸B上述多种生物活性效应与其在体内的代谢产物的关联性研究还需明确；丹酚酸B调节内源性物质释放发挥神经保护活性以及对多种信号通路的影响需更深入的研究。总之，丹酚酸B药理活性的深入研究及在延缓衰老、防治神经系统疾病的应用具有重要的科学、社会意义。