温度胁迫对锥栗幼苗叶片结构及光合特性的影响

王 璐，李艳丽，熊 欢，袁德义，张 勖，邹 锋

（中南林业科技大学经济林培育与保护教育部重点实验室，湖南长沙 410004）

【研究意义】锥栗（Castanea henryi）属于壳斗科（Fagaceae）栗属（Castanea）植物，是我国南方重要的木本粮食树种和重要的生态树种[1]。锥栗果实富含淀粉、脂肪、蛋白质、纤维素及K、Mg、Ca、Fe、P 等营养物质，还含有多种氨基酸和维生素[2]。近几年来锥栗产业在湖南郴州、怀化、吉首、长沙等地发展迅速，成为山区农民重要的经济来源，然而频发的极端天气导致丘陵山地锥栗幼苗的造林成活率低，影响我国丘陵山地锥栗产业健康、稳定的发展。光合作用是植物基本的生命活动，光合器官叶绿体是植物进行光合作用的主要场所[3]，而温度是影响光合作用强弱的重要因子[4]。深入研究温度胁迫下锥栗幼苗叶片结构及光合响应特征，可为锥栗苗木培育的生产实践提供理论指导。【前人研究进展】大量研究[5-7]表明，温度会影响植物的光合作用，植物在适宜的生长温度下，净光合速率最大，低温或高温均会影响植物的光合作用，降低净光合速率。在光的激发下，叶绿素所产生的荧光是深入研究植物光合作用的探针[8]，对叶绿素荧光参数的分析有利于了解过高或过低的温度环境对光合系统的影响程度[9-10]。光合器官叶绿体是植物进行光合作用的主要场所，同时也是植物的敏感部位[11]。李艳艳等[12]证实高温常常会使叶绿体膜结构受到较大损害，淀粉粒膨大并且表面出现皱褶。低温胁迫会导致植物叶肉细胞内叶绿体的形态结构发生明显改变[13]，长时间过低的温度会导致相思树（Acacia confusaMerr.）叶片叶绿体的解体[14]。【本研究切入点】前人研究结果表明高温或低温胁迫影响植物的生长发育，如烟草（Nicotiana tabacum）[15]、葡萄（Vitis vinifera）[16]、番茄（Solanum lycopersicum）[17]和水曲柳（Fraxinus mandshurica）[18]等，然而关于温度逆境对锥栗幼苗的影响尚未见报道。【拟解决的关键问题】研究不同温度胁迫对锥栗幼苗叶片结构及光合的影响，为锥栗苗木的生产实践和栽培管理提供重要的理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选择生长一致的两年生锥栗‘华栗4号’嫁接苗于人工气候室中进行盆栽试验，分别设置3种温度梯度（8，28，38 ℃）处理，每20株锥栗幼苗为一个小区，3次重复，共180株幼苗，处理时间为一个月。

1.2 试验方法

1.2.1 光合参数的测定 使用便携式光合仪Li-6400 测定锥栗叶片光合参数[19]：净光合速率（Pn）、胞间CO2浓度（Ci）、气孔导度（Gs）、蒸腾速率（Tr）。每个处理随机选取3株锥栗幼苗进行测量，每株测定3片完全展开且无病虫害的成熟叶片，每片叶重复测定3次。

1.2.2 荧光参数的测定 利用便携式光合仪Li-6400测定荧光参数[20]：在对锥栗幼苗进行一晚上的暗处理后，得到暗适应下的最大荧光（Fm）。光活化0.5 h 以上，直接测定初始荧光（Fo）、实际光化学量子效率（ΦPSⅡ）、电子传递效率（ETR）、光化学猝灭系数（qP）等参数，根据相关公式Fv/Fm=（Fm-Fo）/Fm可以求出最大光化学效率（Fv/Fm）。每个处理随机选取3株锥栗幼苗进行测量，每株测定3片完全展开且无病虫害的成熟叶片，每片叶重复测定3次。

1.2.3 超微结构的观察 分别取经各温度处理一个月后的锥栗叶片，在叶中部主脉附近切下1 mm 的叶片，用2.5%戊二醛固定，经梯度丙醇脱水，树脂包埋后，用超薄切片机（Leica UC7）切片，醋酸双铀染色，用透射电镜（日立HT7700）观察拍照[21]。

1.2.4 气孔的观察 每个处理随机选取3株幼苗，每株随机选取3个叶片，并采用指甲油法观察气孔[22]，并在倒置显微镜（Leica DMi8）下观察拍照。每个叶片选取2个视野，每视野测2个气孔。

1.3 数据处理与分析

利用Microsoft Excel 2013 和SPSS19.0 进行数据统计分析，并运用Image J 对图片进行相关数据的测定。

2 结果与分析

2.1 温度对叶绿体超微结构的影响

由表1可知，28 ℃处理下，叶绿体长度、宽度和面积分别为4.94µm、3.15µm和13.59µm2；与28 ℃处理相比，8 ℃低温胁迫下，锥栗叶片叶绿体长度和面积显著增大（P＜0.05），分别为7.18µm和15.27µm2；38 ℃高温胁迫下，叶绿体的长度、宽度和面积均显著增大（P＜0.05），分别为5.15µm、3.94µm和16.00µm2。

表1 不同温度下锥栗叶片叶绿体长度、宽度和面积Tab.1 Chloroplast length，width and area of Castanea henryi leaves at different temperatures

根据图1B 和1E 可知，在28 ℃处理下，锥栗叶片叶肉细胞内的叶绿体超微结构正常，叶绿体紧挨细胞膜排列，膜结构完整，被膜清晰，基粒片层排列整齐并且片层结构发达，存在淀粉粒。与之相比，由图1C 和1F 可见，38 ℃高温胁迫下，叶绿体明显膨胀变圆，双层膜模糊，淀粉粒明显变大且数量有所增加。在8 ℃低温胁迫下，叶绿体少许膨胀，同时膜结构受到较大损害，基粒片层结构受到破坏，淀粉粒增大（图1A和1D）。

2.2 温度对气孔结构的影响

由表2 可知，与28 ℃处理相比，8 ℃低温胁迫和38 ℃高温胁迫下气孔长度和气孔宽度均减小，但差异不显著（P＜0.05）。28 ℃处理下，气孔的长度、宽度和开张度分别为27.98，26.51，8.34µm。38 ℃处理下，气孔密度最大，为548.60 个/mm2，但大多数气孔已经闭合（图2C）。锥栗叶片气孔结构在8 ℃和28 ℃下无明显变化（图2A，2B）。

2.3 温度对锥栗幼苗叶片光合参数的影响

由表3可知，锥栗幼苗叶片光合参数在不同温度下差异显著（P＜0.05）。随着温度的增加，锥栗叶片的Pn、Gs、Tr均呈下降趋势。在28 ℃条件下，Pn达到最大值为3.86µmol/（m2·s）。与28 ℃处理相比，8 ℃低温胁迫下，Pn、Gs和Tr分别降低37.04%、22.22%和35.85%；38 ℃高温胁迫下，Pn、Gs和Tr分别降低31.86%、18.51%和34.77%。与28 ℃处理相比，8 ℃和38 ℃条件下，Ci均呈上升趋势，分别升高21.53%和16.14%。

图1 不同温度胁迫对锥栗叶片叶绿体超微结构的影响Fig.1 Effect of different temperature stress on chloroplast ultrastructure of Castanea henryi leaves

表2 不同温度下锥栗叶片的气孔结构参数Tab.2 Stomatal structureof Castanea henryi leaves at different temperatures

图2 不同温度下锥栗叶片的气孔结构Fig.2 Effect of temperature on stomatal structure of Castanea henryi leaves

表3 不同温度下锥栗光合参数Tab.3 Photosynthetic characteristics of Castanea henryiat different temperatures

2.4 温度对锥栗幼苗叶片叶绿素荧光参数的影响

由表4 可知，与28 ℃处理相比，8 ℃和38 ℃处理下的叶绿素荧光参数，除Fm以外，均有显著差异（P＜0.05）。与28 ℃处理相比，8 ℃和38 ℃处理下锥栗叶片的Fo均呈上升趋势，分别增加21.28%和15.60%；8 ℃低温处理下，Fv/Fm下降了4.88%，而38 ℃的高温处理对Fv/Fm的影响并不明显。ΦPSⅡ和qP在28 ℃的处理下出现最大值；与之相比，8 ℃低温处理下，ΦPSⅡ下降了29.11%，qP下降29.41%；38 ℃高温处理下，ΦPSⅡ下降了32.91%，qP下降35.29%。

表4 不同温度下锥栗幼苗叶片的叶绿素荧光参数Tab.4 Chlorophyll fluorescence parameters of Castanea henryi at different temperatures

3 结论与讨论

叶绿体超微结构的变化直接反映了叶片光合能力的大小[23]。武立权等[24]证明高温胁迫会破坏水稻（Oryza sativaL.）黄叶突变体剑叶叶绿体超微结构，减弱叶片的光合能力。黎明等[25]在研究中发现低温环境将导致植物叶绿体形态结构发生明显变化。本研究表明，8 ℃低温胁迫和38 ℃高温胁迫均会影响叶绿体的结构，从而影响锥栗幼苗叶片的光合作用，使得Pn降低。但并未出现如尤扬等[26]研究发现的长时间低温使叶绿体解体现象，导致这一研究结果有差异的原因可能是本文设置的8 ℃低温处理一个月并不足以导致锥栗幼苗叶绿体解体，尚需进行更低温度和更低时间的设置研究来验证。

气孔是植物体与外界之间的气体交换通道[27]，有研究表明，增温可以通过改变植物叶片的气孔结构特征影响CO2气体经气孔扩散到光合反应位点的路径和时间，从而影响光合作用[28]。本研究结果表明，在38 ℃下，气孔密度最大，但大多数气孔处于关闭状态。植物在高温环境下，通过增加气孔密度，以加强蒸腾作用来降低植物体本身的温度，是植物的一种自我保护机制。然而，随着高温胁迫时间的增加，致使保卫细胞失水过多，从而导致大量气孔关闭[29]。

光合作用是植物把无机物转化为有机物的重要途径，Pn反映植物光合作用的强弱[30]。本研究表明，8 ℃低温或38 ℃高温胁迫均会使植物光合作用减弱，与郝向春等[31]研究结果一致。植物光合作用的减弱原因可分为两种，包括气孔因素和非气孔因素，因此检查Pn下降的主要原因是不是气孔限制，不仅需要看气孔导度，还要确定胞间CO2浓度的变化趋势[32]。本研究中在8 ℃低温胁迫和38 ℃高温胁迫时，Gs与Ci的变化趋势不一致，说明Pn降低的主要原因是非气孔因素，这与杨利云等[33]的研究结果类似。

对叶绿素荧光参数的分析有利于了解过高或过低的温度环境对光合系统的影响程度[34]。本研究表明，与28 ℃处理相比，8 ℃和38 ℃处理下qP明显下降，Fo显著升高，说明了低温或高温胁迫的环境下电子传递受阻，这与在大叶黄杨（Euonymus japonzcusThunb）[35]、烤烟（Nicotiana tabacumL.）[36]和紫菜（Por⁃phyraspp.）[37]上的研究结果相似。8 ℃低温胁迫导致Fv/Fm和ΦPSⅡ的值均显著下降，而38 ℃的高温胁迫对Fv/Fm值影响较小，说明锥栗更耐38 ℃高温胁迫，这与莫亿伟等[38]对柱花草（Stylosanthes guianensis）的研究结果类似。

综上所述，28 ℃处理下，锥栗幼苗叶片的叶绿体结构完整和气孔结构正常，净光合速率最大，而38 ℃高温和8 ℃低温胁迫均会在一定程度上改变叶绿体和气孔结构，影响锥栗幼苗叶片的光合作用，降低净光合速率。