种子活力或抗老化能力的分子机制研究进展

姜孝成,周诗琪

(湖南师范大学生命科学学院作物不育资源创新与利用湖南省重点实验室,中国湖南长沙410081)

种质资源(germplasm resources)是生物遗传信息的载体,是现代种业的核心竞争力和农业科技原始创新的物质基础,是保障国家粮食、生态及能源安全的重要战略性资源[1]。为避免种质资源的丢失,有必要对其安全保存[2]。种子是种质资源保存的重要载体,但生理成熟后的种子在贮藏过程中质量会不可逆转地逐渐下降,这种变化称为老化或劣变(aging or deterioration)。种子因老化而面对外界胁迫挑战的脆弱性增加,种子活力降低[3]。种子老化程度因贮藏条件不当特别是高温高湿条件而不断加重[4～5]；在此期间,种子内部会发生一系列有害变化,例如种皮机械耐性下降[6]、细胞膜损伤、蛋白质变性、DNA损伤和突变、核酸合成系统破坏等[7～9],最终导致种子活力的丧失。如果种子在贮藏过程中老化或活力下降的问题得不到解决,就会造成种子萌发迟缓、生长势差、抗逆性弱、生物产量和经济产量降低,从而影响农业生产。近年来,随着分子生物学研究技术的发展,特别是高通量测序技术和各种组学技术等的更新换代,在种子活力或抗老化能力方面的分子机制研究取得了显著进展,本文进行了相关综述,试图为进一步利用分子生物学技术手段提高农作物种子活力或抗老化能力,高效保存种质资源提供理论依据。

1 主要农作物种子活力或抗老化能力相关QTLs和候选基因鉴定

生物中大多数可见性状的遗传变异是受多基因控制的,这些性状被称为数量性状,控制数量性状的单个基因座(individual loci)即称为QTL(quantitative trait loci)。种子活力即是由多基因控制的数量性状,适合QTL分析[10～15]。QTL分析首先根据某标记基因将待测群体划分为不同的基因型类别,然后使用相关统计分析来确定某个基因型的个体与其他基因型的个体在所测量的性状(表型)方面是否存在显著差异；如果表型显著不同,即被认为影响该性状的基因与标记基因连锁；然后对整个基因组中的其他标记基因重复该分析过程,以检测出尽可能多的与该性状连锁的标记基因。由于无法确定该性状是否是与标记基因连锁的一个或多个基因相关,因此创造了数量性状基因座(QTL)一词来描述对数量性状有显著影响的染色体区域(通常通过与标记基因的连锁来定义)[16]。确定一个QTL是否由一个或多个基因组成一直是数量遗传学中最困难的工作之一。近年来,水稻(Oryza sativa)、小麦(Triticum aestivum)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)等主要农作物中与种子活力或抗老化相关的QTLs及候选基因鉴定备受关注。

1.1 水稻种子活力或抗老化能力相关QTLs和候选基因鉴定

杂交水稻自1976年开始商业化种植,目前已覆盖中国水稻总种植面积的50%以上。但杂交水稻种子由于贮藏耐性差或贮藏措施不当而导致种子质量下降,严重影响水稻生产的情况时有发生。因此,了解水稻种子活力或抗老化能力的分子机制,培育出种子贮藏耐性好的杂交水稻基因型至关重要[17～18]。Li等[18]使用来自粳稻 CJ06 和籼稻TN1的杂交后代的DH(double haploid)株系群体,在12条染色体上检测到19个与种子活力相关的QTLs,其中与萌发率相关的QTL qGP9定位在9号染色体(chromosome 9,Chr9)上。幼苗活力是种子活力的表现之一,直接影响水稻的健壮成苗。Xie等[19]使用籼稻珍汕97和明恢63杂交的重组近交系(recombinant inbred lines,RILs)定位了8个与种子活力相关的QTLs,其中,qSV-1、qSV-5b、qSV-6a、qSV-6b和qSV-11影响幼苗建成,qSV-5a、qSV-5c和 qSV-8仅影响发芽；此外,qSV-1、qSV-5b、qSV-6a、qSV-6b 和 qSV-8 是低温特异性QTLs。Abe等[20]利用来自粳稻Kakehashi和Dunghan Shali杂交的RILs,鉴定到4个与苗高相关的QTLs,其中,控制苗高的qPHS3-2定位于Chr3长臂末端,并在该位点预测到一个与赤霉素(gibberellin,GA)生物合成相关的候选基因——OsGA20ox1。Jin 等[21]以野生稻(Oryza longistaminata)与籼稻9311杂交后,再以9311作为轮回亲本得到的BC2F20回交株系(backcross inbred lines,BILs)为材料,运用基因组重测序技术进行基因分型,检测到与种子活力相关的36个QTLs；其中,老化过程中种子萌发能力相关的q9GR8.1与q9GP8.1拥有相同的定位,该位点包含8个候选基因(MH08g0-020600、MH08g0020700、MH08g0020800、MH08g-0020900、MH08g0021000、MH08g0021100、MH08-g0021200和MH08g0021-300)；老化处理种子萌发后的幼苗长度相关的q9SL1.1与q3SL1.1和q6SL1.1有相同定位,该位点鉴定到15个候选基因(MH01g0725700、MH01g0725800、MH01g0725-900、MH01g0726000、MH01g0726100、MH01g072-6200、MH01g0726300、MH01g0726400、MH01g07-26500、MH01g0726600、MH01g0726700、MH01g0-726800、MH01g0726900、MH01g0727000 和 MH-01g0727100)。Sasaki等[22]从来自 Milyang23/Akihikari的RILs,检测到了4个与种子寿命相关的QTLs(RC7、RC9-1、RC9-2 和 RC9-3)。Jiang等[23]从来自Milyang23/Tong88-7和Dasanbyeo/TR22-183的两组RILs,发现了8个与种子贮藏耐性相关的 QTLs(qMT-SGC1.1、qMT-SGC5.1、qMTSGC7.1、qMT-SGC7.2、qMT-SGC9.1、qDT-SGC2.1、qDT-SGC3.1 和 qDT-SGC9.1)。Li等[24]利用 Koshihikari/Kasalath的BILs种子,鉴定到位于Chr2、Chr3、Chr4、Chr6、Chr9 和 Chr11 上与种子贮藏耐性相关的 6 个 QTLs(qSS-2、qSS-3、qSS-4、qSS-6、qSS-9 和 qSS-11)。Miura 等[11]使用 Nip-ponbare/Kasalath的BILs,在Chr2、Chr4和Chr9上鉴定到3个与种子寿命相关的QTLs(qLG-2、qLG-4和qLG-9)。Zeng等[25]利用来自籼粳杂交ZYQ8/JX17的DH株系，检测到分别位于 Chr9、Chr11和Chr12上的与种子贮藏耐性相关的3个QTLs(qLS-9、qLS-11和qLS-12)。Xue 等[26]使用来自籼粳杂交IR24/Aso-minori的RILs,获得了分别位于Chr1、Chr3和Chr9上与种子贮藏耐性相关的3个QTLs(qRGR-1、qRGR-3 和 qRGR-9)。Lin 等[27]使用以N22作为共同亲本的Nanjing35(ja-ponica)/N22//Nanjing35的BILs和USSR5(japoni-ca)/N22的 RILs,在Chr1、Chr2、Chr5、Chr6 和 Chr9 上鉴定到7个QTLs,包括两个群体种子所共有的qSSn-9,只存在于 BILs的 qSSnj-2-1、qSSn-2-2、qSSn-5、qSSn-6和只存在于RILs的qSSn-1。Hang等[28]利用Sasanishiki(粳稻)/Habataki(籼稻,有强贮藏耐性)//Sasanishiki的 BILs,在 Chr1、Chr2、Chr3、Chr4、Chr5、Chr7、Chr11 和 Chr12上鉴定到与种子贮藏耐性相关的13个QTLs,其中两个QTLs(qSSh-2-1和qSSh-2-2)与自然和人工老化均相关,4个 QTLs(qSSh-4、qSSs-5-1、qSSs-5-2和 qSSh-12)和 7 个 QTLs(qSSh-1、qSSh-3-1、qSSh-3-2、qSSh-3-3、qSSh-7-1、qSSh-7-2 和 qSSh-11)分别与自然和人工老化相关。Yuan等[29]利用粳稻Nipponbare和籼稻9311的杂交后代的BILs,鉴定到位于 Chr1、Chr2、Chr3、Chr8、Chr9 和 Chr11 上与种子贮藏耐性相关的7个QTLs(qSS1、qSS2、qSS3.1、qSS3.2、qG6S8、qG6S9 和 qG6S11),其中qSS1被证实与种子贮藏耐性的改良有关,qSS3.1为种子贮藏耐性和抗氧化胁迫能力所共有；并从qSS3.1中筛选到1个编码脂肪酸羟化酶的候选基因OsFAH2,过表达OsFAH2能降低种子中脂质过氧化和提高种子贮藏耐性。

1.2 小麦、玉米和大豆等农作物种子活力或抗老化能力相关QTLs和候选基因鉴定

当前,小麦、玉米和大豆等农作物中与种子活力或抗老化能力相关的QTLs也有报道。Shi等[30]利用小麦Hanxuan 10×Lumai 14杂交后代的DH品系,挖掘出与种子活力相关的49个QTLs,分别定位 于1B、2D、3A、3B、3D、4A、4D、5A、5B、5D、6D和7A等12条染色体上,并从Chr5B上分布的13 个 QTLs(QGEe5B、QGIe5B、QSLc5B、QSLd5B、QSLf5B、QRLd5B、QRLe5B、QRLf5B、QVId5B、QVIe5B、QVIf5B、QSVId5B 和 QSVIe5B)鉴定到 7 个候选基因(gRAESCS5B01G564900、gRAESCS5B0-1G5642 00、gRAESCS5B01G562600、graesCS5B02-G562700、gRAESCS5B01G561300、gRAESCS5B01-G561400和gRAESCS5B01G562100),这些基因主要参与调节老化种子萌发期间的碳水化合物和脂质代谢,转录和细胞分裂等。Han等[31]基于两个玉米杂交组合Yu82×Shen137和Yu537A×Shen137,通过单粒系选法获得两类F10RIL群体,鉴定到与种子活力相关的65个QTLs,其中61个QTLs被整合为18个meta-QTLs(mQTLs)(用Bio-Mercator 2.1对每条染色体上的QTLs进行整合分析,当整合得到的某个QTL簇是两类RIL群体共有时称为1个mQTL),并从13个mQTLs(mQTL1-1、mQTL1-2、mQTL3-1、mQTL3-2、mQTL3-3、mQTL3-4、mQTL4-2、mQTL4-3、mQTL5-2、mQTL6-1、mQTL6-2、mQTL7-1 和 mQTL7-2)中鉴定到与玉米种子活力相关的24个候选基因(226532762、224061823、242056533、195605946、162459222、327195227、302810918、At1g45050、224143836、162459414、At5g19550、AT5G51440、195658029、226508796、At3g04120、326509331、AT1G57720、At5g67360、45238345、At1g70730、AT1G09640、226247007、AT1-G56340 和 AT3G21720),它们主要参与糖酵解途径和蛋白质代谢；且推测mQTL2、mQTL3-2、mQTL3-4和mQTL5-2的染色体区域可能是与种子活力相关的热区(hot spots)。Zhang等[32]以大豆品种Zhengyanghuangdou×Meng 8206(ZM6)与 Linhefenqingdou × Meng 8206(LM6)杂交的两个RILs为材料,共鉴定出11条染色体上与种子贮藏耐性相关的34个QTLs,其中21个QTLs分布在 4条染色体(Chr3、Chr5、Chr17和 Chr18)上5个QTL簇中,位于Chr17和Chr5的两个簇上的QTLs的密度最高,各有7个QTLs(qrGR-17-1、qr-GR-17-2、qrFW-17-1、qrFW-17-2、qrGR-17-3、qrSL-17-1 和 qrFW-17-3)和 6 个QTLs(qGR-5-1、qGR-5-2、qFW-5-1、qGR-5-3、qFW-5-2 和qrSL-5-1),分别被定义为QTL hotspot A和QTL hotspot B。研究人员从这两个热点区域中已筛选到与种子发育、萌发和休眠,种皮形成,脂肪酸/脂质代谢过程和种子贮藏耐性等相关的19个候选基因(Glyma05g25030、Glyma05g25320、Glyma05g25460、Glyma05g25970、Glyma05g26150、Glyma05g26830、Glyma05g27190、Glyma05g27240、Glyma05g27250、Glyma05g28250、Glyma05g28950、Glyma05g29190、Glyma05g28030、Glyma05g28720、Glyma17g36080、Glyma17g36620、Glyma17g36730、Glyma17g37090和Glyma17g37110),但这些候选基因调控种子活力或抗老化能力的分子作用机制及哪个或哪些是关键基因或主效基因、彼此间是否存在相互作用等尚未见报道。

2 GWAS和多组学分析优化种子活力或抗老化能力相关QTLs和候选基因

2.1 GWAS用于鉴定种子活力或抗老化能力相关QTLs和候选基因

全基因组关联分析(genome-wide association study,GWAS)是以研究对象的基因组中大量单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)为分子遗传标记,通过将SNPs与某数量性状进行连锁作图,来获得该性状的QTLs的分析方法。与QTL连锁分析相比,GWAS通常使用大量不相关的多样化种质为试验材料,以增加等位基因和单倍型的多样性,从而克服了QTL分析只能在特定F2代的杂交亲本之间或RIL群体内进行等位基因多样性分析,以及遗传图谱分辨率受到重组株系数量限制的缺点[33～34]。近年来,GWAS在种子抗老化能力的分子机制研究上已得到广泛应用。

Renard等[35]对经自然老化和加速老化处理后的270个自然变异的拟南芥(Arabidopsis thaliana)种质的种子进行GWAS分析,确定了多个与种子寿命相关的基因区域,在Columbia生态型中鉴定到20个与种子活力相关的候选基因,其中7个(PSAD1、SSLEA、SSTPR、DHAR1、CYP86A8、MYB-47和SPCH)与种子寿命正相关,5个(RBOHD、RBOHE、RBOHF、KNAT7 和 SEP3)与种子寿命负相关；且证明氧化胁迫相关的RBOHs(NADPH氧化酶基因)、DHAR1(脱氢抗坏血酸还原酶基因)和PSAD1(光系统Ⅰ亚基基因)在种子老化过程中扮演主要角色,CYP86A8(细胞色素P-450羟化酶基因)和转录因子基因(MYB47、KNAT7 和 SEP3)在种子老化过程中对种皮有保护作用。

通过GWAS分析,熊豆[36]从271份水稻种质中共检测到48个种子贮藏耐性相关SNPs,其中,3个SNPs与人工老化处理相关联,45个SNPs与自然老化相关联；同时,从其中两个SNPs dd110-00467(Chr11_21953047)和id11008475(Chr11_22-000109)的上、下游各100 kb区域内鉴定到控制水稻种子贮藏耐性的两个候选基因Os011g37640和Os011g37730,它们在发芽率高的材料中的相对表达水平显著低于发芽率低的品种。Lee等[37]从299个籼稻种质中鉴定到与种子寿命相关的8个候选基因(Os03g51050、Os04g01160、Os04g01280、Os09g37250、Os11g01439、Os03g06890、Os03g069-00和Os03g03870),它们主要参与DNA修复、转录、糖代谢、活性氧(reactive oxygen species,ROS)清除以及胚胎和根发育过程等。Wu等[38]从456个不同水稻种质中发现了9个新的QTLs(qSS1-1、qSS1-2、qSS2-1、qSS3-1、qSS5-1、qSS5-2、qSS7-1、qSS8-1和 qSS11-1),其中,qSS1-2和 qSS8-1分别与已报道的qSS1/OsGH3-2和OsPIMT1共定位；并发现这些QTLs可以很好地解释为何水稻籼亚种的种子的贮藏耐性优于粳亚种的种子。最近,Yuan等[39]通过对不同水稻种质的种子进行GWAS分析发现,吲哚-3-乙酸(IAA)-酰胺合成酶基因(GRETCHEN HAGEN3-2,OsGH3-2)是一个种子贮藏耐性相关基因,OsGH3-2主要在发育的种子中表达并催化IAA与氨基酸结合,使其形成无活性的生长素；OsGH3-2的过表达显著降低种子的贮藏耐性,而基因敲除或敲低增强种子的贮藏耐性；OsGH3-2可能通过调节脱落酸(abscisic acid,ABA)信号途径作为种子贮藏耐性的负调节因子。Shi等[40]对478个不同水稻品种的种子在盐胁迫条件下的萌发相关性状进行GWAS分析,鉴定到11个与耐盐性显著相关的QTLs,其中位于Chr2的一个QTL包含两个硝酸盐转运蛋白家族基因OsNRT2.1和OsNRT2.2,其表达受到盐胁迫的影响。Magwaa等[41]对350个水稻indica、japonica和Aus亚型品种的种子休眠特性进行GWAS分析,鉴定到16个SNPs与新鲜收获种子的萌发率相关联,38个SNPs与后熟种子的萌发率相关联(其中3个也是存在于新鲜收获种子中的SNPs)；在新鲜收获种子中,有3个关联SNPs与GA/IAA钝化基因GA2ox3、EUI1和GH3-2以及休眠基因Sdr4距离约100 kb；在后熟种子中,有1个关联SNP毗邻ABA信号转导基因ABI5。

胚芽鞘长的小麦品种对于深播种植有积极意义。然而,对GA不敏感的矮化基因Rht-B1b和Rht-D1b的广泛使用不利于培育具有胚芽鞘长的矮化小麦品种。Li等[42]对893个小麦品种进行GWAS分析,鉴定到8个胚芽鞘长度相关QTLs(QCL.stars-4DC1、QCL.stars-4BS1、QCL.stars-2DC1、QCL.stars-2DS1、QCL.stars-5BL1、QCL.stars-1BS1、QCL.stars-4BS2和QCL.stars-5B/5D),且证明Rht-B1b和Rht-D1b的表达显著降低胚芽鞘长度。种子活力也影响幼苗的根系统建成(root system archi-tecture,RSA),该性状对于农作物在胁迫条件下的水分和养分利用十分重要。Alemu等[43]对192个小麦品种进行GWAS分析,鉴定到38个RSA相关QTLs,其中 4个QTLs(EPdwRGA-6A、EPdwRDW-4A、EPdwiTGW-3B.1和 EPdwIRW-5A)特别是 EP-dwRGA-6A可能对RSA起关键作用。

Nagel等[44]通过对175个大麦(Hordeum vulgare)品种的种子进行GWAS分析,发现了基因型、非生物和生物胁迫影响种子老化和寿命的107个标记性状关联(marker trait associations,MTAs)；未发现种子老化与脂溶性生育酚、油、淀粉和蛋白质含量之间存在相关性；而长期干燥贮藏或人工老化处理的种子中,水溶性谷胱甘肽和相关硫醇转化为二硫化物,表明其细胞内变得更具氧化性；不同贮藏和老化方式影响细胞内pH和生化过程进而导致种子老化；此外,种子响应老化处理或贮藏耐性似乎受到母本环境(maternal environment)和遗传背景的显著影响。

Huang等[45]对 650个燕麦(Avena sativa)株系种子活力相关性状进行GWAS分析,获得根、芽性状相关QTLs分别为34个和16个,各对应于41个和16个SNPs；其中5个性状关联位点的序列与水稻、短柄草和玉米的同源序列匹配,且3个性状关联位点的序列与种子活力相关的基因匹配,分别是葡糖醛酸基转移酶基因(Os01g067550-0、Bradi2g46410 和 Zm00001d043879)、包含线粒体载体蛋白结构域的蛋白编码基因(Os03g0191100、Bradi1g71800、Zm00001d048218 和 Zm00001d02-8008)和铁硫簇蛋白基因(Os06g0146400d、Bradi-1g51010.1d 和 Zm00001d036145)。

Upadhyaya等[46]对242份高粱(Sorghum bicolor)种质进行GWAS分析,发现1个SNP关联位点(Locus 7-2)与种子的低温发芽显著相关,该位点与高粱耐寒性相关的QTL qSbCT07.10共定位[47],并鉴定到1个编码CBL(calcineurin B-like protein)-互作蛋白激酶的候选基因(007G140900),该基因与水稻Chr8上的耐冷性基因LOC_Os08g34240高度同源[48～49],其小麦同源基因(TaCIPK14)在烟草中过表达时,能提高烟草种子的耐寒性和发芽率[50]。

通过GWAS分析,Tan等[51]从520个油菜(Brassica napus)品种中鉴定到干旱和盐胁迫条件下23个SNPs关联位点与种子萌发率相关,20个SNPs关联位点与种子萌发指数相关,其中,位于Chr_C08的SNP关联位点与盐和干旱响应基因BnaC08g41070距离3.32 kb,位于Chr_A4的SNP关联位点与干旱响应基因BnaA04g02620D距离2.20 kb,位于Chr_C06的SNP关联位点与干旱响应基因BnaC06g01910D重叠；此外,还鉴定到37个与干旱和盐胁迫下种子萌发率或萌发指数相关的候选基因,且这些候选基因大多数调节信号转导和脯氨酸生物合成,或编码泛素连接酶(ubiquitin ligase)E3。Hatzig等[52]从248个油菜品种中鉴定到几个候选基因所在的基因组区间与种子萌发率、萌发速率、幼苗生长和千粒重等性状相关联,且其中有些是拟南芥基因SCO1(SNOWY COTYLEDON 1)、ARR4(ARABIDOPSIS TWO-COMONENT RES-PONSE REGULATOR 4)和ATE1(ARGINYL-t-RNA PROTEIN TRANSFERASE 1)的同源基因。Luo等[53]基于442个油菜品种在低温和正常温度条件下的种子萌发和幼苗生长特性差异,鉴定到22个与种子活力的低温胁迫耐性显著关联的QTLs,并从中筛选到62个候选基因,这些基因的功能涉及DNA修复、RNA翻译、线粒体激活和能量产生、蛋白质的泛素化和降解、抗氧化系统以及植物激素和信号转导等,其中最值得关注的有BnaA03g40290D、BnaA06g07530D、BnaA0-9g06240D、BnaA09g06250D和BnaC02g10720D等。

2.2 多组学分析鉴定种子活力或抗老化能力相关基因及其代谢途径

种子活力或抗老化能力的多组学(multi-omics)分析包括全基因组水平上的转录组学、蛋白质组学、降解组学和代谢组学分析等,可全面鉴定相关基因及其代谢途径[54]。

2.2.1 基因组学和蛋白质组学分析鉴定种子活力或抗老化能力相关基因及其代谢途径

迄今为止,已有大量与种子活力相关的转录组学和蛋白质组学的研究报道。

Li等[55]通过对寿命长短不一的两个玉米株系的种子进行人工老化处理前后的转录组比较分析,从差异表达基因中挖掘出13个可能与种子寿命相关的基因(GRMZM2G058970、GRMZM2G3-02913、GRMZM2G358618、GRMZM2G375807、GRMZM2G379913、GRMZM2G379929、GRMZM2G43-8938、GRMZM5G867767、GRMZM2G181135、GRMZM5G800586、GRMZM5G877838、GRMZM2G07-4604和GRMZM5G824439),其中11个基因在Chr3上,2个基因在Chr5上,10个基因有注释信息。Gu等[56]对20个含油量不同的油菜品种种子进行蛋白质组学和基因组学整合分析,鉴定到165个差异蛋白质；含油量高的种子具有较高的代谢活性,尤其是含硫氨基酸代谢；31个特有基因在高含油量和低含油量种子的萌发过程中表现出显著差异,其中13个基因(BnaC-01g43710D、BnaC-06g19960D、BnaC06g20420D、BnaA07g20290D、B-naA07g20210D、BnaA06g16950D、BnaC04g42010-D、BnaC06g09330D、BnaC03g70070D、BnaA07g33-310D、BnaC06g38200D、BnaC06g14990D 和 BnaC-06g14670D)可能与种子萌发活力相关。

针对具有不同活力水平的拟南芥种子的比较蛋白质组学结果表明,蛋白质合成能力、贮藏物质动员和细胞解毒作用相关蛋白质与种子活力密切相关[57]。Catusse等[58]分别对吸水促萌和人工老化处理获得的不同活力的甜菜种子进行比较蛋白质组学分析,发现有18个蛋白质在吸水促萌处理时上调,老化处理时下调,且老化处理后再经吸水促萌处理时又上调；另有11个蛋白质则表现出相反的丰度变化。这些蛋白质涉及脂类和淀粉的动员、蛋白质合成或甲基循环等代谢途径,乙醛酸酶、异柠檬酸裂解酶、蛋白质合成能力以及ABA信号途径等相关的蛋白质被认为可能是种子活力的主要参与者。杂交水稻和白杨种子的蛋白组学研究也发现,能量代谢、细胞防御和修复相关蛋白质、贮藏蛋白、胚乳中与贮藏物代谢分解相关的酶、蛋白质合成与转运相关蛋白质等在种子人工老化后变化很明显,特别是胚中的糖酵解相关酶类以及丙酮酸脱氢酶和乙醇脱氢酶在种子老化期间丰度显著增加,暗示它们与种子活力变化有关[59～60]。大豆种子的发育通常对高温和高湿敏感,Wei等[61]研究发现,种子发育阶段对高温高湿耐性不同的两个品种在子叶、胚和叶中分别有120、144和438个丰度差异蛋白质,这些蛋白质功能主要涉及信号转导、三羧酸循环、脂肪酸代谢、光合作用、蛋白质加工、折叠和组装、蛋白质生物合成或降解、植物-病原体相互作用、淀粉和蔗糖代谢以及氧化应激反应等代谢途径和细胞过程,且高耐品种的细胞超微结构、上述代谢途径和生理生化变化较小。Chen等[62]对不同含水量的燕麦种子在不同温度条件下处理一定时间的蛋白质组和生理生化变化进行比较和关联分析,获得21个丰度有显著差异的蛋白质,其中包括随种子老化而下调的19个蛋白质和上调的2个蛋白质；下调蛋白质中有6个热激蛋白(heat shock proteins,HSPs)和2个ATP合酶,参与碳水化合物和能量代谢、平衡其他蛋白质的合成与降解等；上调蛋白质中有1个是精氨基琥珀酸合成酶(argininosuccinate synthase),参与脯氨酸合成,可维持细胞中ROS稳态,对于种子的热胁迫抗性十分重要。另有研究表明,OsHSP18.2(Ⅱ类胞质HSP)是一个老化反应蛋白质,在人工老化处理的水稻种子中丰度显著上调；OsHSP18.2的转录产物在种子成熟后期显著增加,在干种子中含量很高,而在种子发芽后急剧减少。生化分析表明,OsHSP18.2通过形成同源十二聚体,作为分子伴侣发挥作用,可防止柠檬酸合酶的热失活,因此研究者认为OsHSP18.2可能通过限制ROS积累来保护和稳定细胞中酶的结构和功能,使其免受不可逆损伤,在种子成熟干燥、老化和萌发过程中,提高种子活力、寿命和有利于幼苗建成[63]。Wang等[64]研究了花生萌发种子胚轴不同部位脱水耐性及其蛋白质组学差异,发现一些特殊的LEA(late embryogenesis abundant)蛋白、脱水素(dehydrin)、钙调蛋白(calmodulin)、脂氧合酶 3(LOX3)、ABA 响应蛋白以及脱毒反应相关蛋白质等的丰度与胚轴不同部位的脱水耐性高度相关。

miRNAs也参与种子活力或抗老化能力的调控,其中miR164c的表达与种子活力负相关,而miR168a的表达与种子活力正相关[65]。通过转录组学以及蛋白质组学差异分析和基因-蛋白质互作分析,研究人员发现miR164c通过其靶基因PSK5和TIL1调控核心基因RPS27AA,后者通过其下游的六大类功能蛋白质,包括胁迫响应、内质网蛋白加工、胚发育、丝氨酸内肽酶抑制剂、能量代谢和“其他”关联蛋白质,共同调控水稻种子活力或抗老化能力[66]。

2.2.2 代谢组学分析鉴定种子活力或抗老化能力相关的代谢标志物

代谢组学(metabonomics/metabolomics)分析指对生物体内所有代谢物进行定量分析,以探讨代谢物与生物体生理病理变化的关系。近期,该技术已被用于鉴定种子老化程度或种子寿命的代谢标志物(metabolic markers)。

种子引发(seed priming)是改善种子活力的重要措施。最近,基于纳米材料的小尺寸和独特的物理化学特性,纳米引发物开始应用于种子萌发特性的改良。比如,使用洋葱(Allium cepa)提取物作为还原剂合成银、金纳米颗粒,以及使用食品工业副产品柑橘籽油和去除姜黄素后的姜黄油树脂制备纳米乳液,用于引发洋葱种子,可增加种子发芽率和出苗率；代谢组学研究表明,纳米材料引发处理后洋葱种子和幼苗中的ABA和顺式-(+)-12-氧代植物二烯酸(cis-(+)-12-oxo-phytodienoic acid)的产生受到显著抑制,萌发促进物如γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid)和玉米素(zeatin)的含量则增加[67]。适当浓度的激动素处理苜蓿(Medicago truncatula)种子可加速其萌发,但会伤害幼苗生长。采用非靶向代谢组学(non-targeted metabolomics)分析经水和0.5 mmol/L激动素分别浸泡2 h和8 h的苜蓿种子以及胚根伸出阶段种子中的代谢物组成,结果表明,无论是水或激动素浸泡处理,五磷酸肌醇、胍丁胺、二半乳糖基甘油、六磷酸肌醇和油酰胆碱等是3个不同处理的种子中主要的差异代谢物；27种代谢物的平均相对含量在激动素与水处理之间形成显著差异,但仅发生在胚根伸出阶段；这些代谢物消耗可能与种子更快的发芽有关；较长时间暴露于激动素引起的DNA损伤或基因毒性损伤(genotoxic injury)可能是激动素伤害幼苗生长的原因[68]。

Chen等[69]对来自4个不育系和4个恢复系的16个杂交水稻组合的种子进行人工老化和自然老化处理后的代谢组学分析,共鉴定出56个代谢物,其中大多数与初级代谢有关；在种子老化过程中,半乳糖、葡萄糖酸、果糖和甘油的含量显著增加；绝对定量结果表明,在不同老化处理下,半乳糖和葡萄糖酸与种子的发芽率极显著负相关；棉子糖的相对含量在种子贮藏过程中变化不大,但与人工老化种子的发芽率显著正相关。Min等[70]将正常组和人工老化组人参种子均用赤霉素处理后,使用气相色谱-质谱(GC-MS)分析比较两组样品之间的代谢物变化,确定了44种内源性代谢物,其中9种含量呈显著差异的代谢物可作为预测人参种子寿命的潜在标志物。

2.2.3 降解组学分析鉴定种子活力或抗老化能力相关的miRNAs及其靶基因

降解组测序(degradome sequencing)主要针对miRNA介导的mRNA剪切片段进行测序,从而筛选miRNA作用的靶基因。降解组学分析已用于鉴定与种子活力或抗老化相关miRNAs及其靶基因。Gong等[71]分别对正常的和人工老化处理2 d的玉米种子进行miRNA测序,共发现27个差异表达的miRNAs,其中10个被RT-qPCR证实；降解组测序共鉴定到1 142个可能被131个miRNAs切割的靶转录本,其中9个差异表达的miRNAs的26个靶基因可能在种子活力调控中发挥作用。Huang等[72]分别对二倍体水稻和四倍体水稻的种子进行老化处理,结果表明,四倍体水稻种子的抗老化能力强于二倍体水稻种子。降解组测序发现,Osa-miR164d的靶基因转录本的降解片段只在四倍体水稻种子中检测到,推测OsamiR164d可能通过调控靶基因的差异表达参与调控水稻种子抗老化能力,该结果与本研究室关于miR164c调控水稻种子活力的作用机制[65～66]一致。

3 种子活力或抗老化相关基因的功能及其分子作用机制研究

基因编辑技术是研究基因生物学功能的主要手段,包括过表达(overexpression)转基因技术、基因敲除或敲减技术(knockout/knockdown)、基因沉默(RNAi)技术等[73～75]。这些技术在种子活力或抗老化能力相关基因的功能及其分子作用机制研究中发挥了重要作用。

3.1 活性氧毒性清除相关基因的功能及其分子作用机制

种子在脱水、贮藏和萌发过程中,不断地产生有毒副产品ROS,导致种子劣变以致寿命下降。ROS的毒性源于其不加区别地与细胞中几乎所有组分如脂质、蛋白质和DNA等发生反应。由ROS引起的基因组伤害被认为是种子老化的重要原因之一,如引起DNA中形成7,8-二氢-8-氧鸟嘌呤(7,8-dihydro-8-oxoguanine,8-oxo-G),该产物在DNA复制过程中与腺嘌呤而不是胞嘧啶形成碱基对,从而导致GC→TA颠换。有研究表明,拟南芥中的AtOGG1参与碱基切除修复,清除DNA中的8-oxo-G。AtOGG1的转录本在种子干燥和萌发吸水过程中显著上调,同时在转基因种子中8-oxo-G含量下降,提示过表达该基因增强了种子的非生物胁迫耐性,延缓老化,进而延长种子寿命[76]。另外,在许多植物中,1-Cys过氧化物酶(1-cys peroxiredoxin,1-Cys Prx,也称为PER1)是一类种子专一性抗氧化剂,可保护半胱氨酸残基免受ROS的伤害。Chen等[77]从荷花(Nelumbo nucifera Gaertn)种子中鉴定和表征了NnPER1蛋白,NnPER1能够保护DNA免受ROS的切割,NnPER1的转录和蛋白质积累在种子干燥、吸涨以及非生物胁迫处理期间增加；NnPER1在拟南芥中的异位表达可提高拟南芥种子的寿命和抗老化能力,且转基因种子中ROS和脂质过氧化水平显著低于野生型种子。

3.2 脂氧合酶基因的功能及其分子作用机制

膜脂的过氧化和自由基的增殖是种子活力下降的两个重要原因[10]。脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)是催化不饱和脂肪酸代谢的关键酶之一,随着LOX活性的增加,不饱和脂肪酸的水平降低,脂肪酸被氧化,形成自由基,然后种子迅速变质[14]。LOX家族的一些成员在种子萌发过程中起到降解脂质的作用。在种子贮藏过程中,由于LOX活性增强,不饱和脂肪酸发生过氧化反应,会直接导致种子活力降低和谷物营养品质变差,因此LOX与种子寿命和抗老化能力关系密切,通过RNAi技术降低种子中LOX活性可以提高种子的抗老化能力[78]。比如,与野生型相比,过表达OsLOX2水稻株系的种子在正常条件下萌发加速,贮藏过程中种子加速老化,活力加速降低；而OsLOX2的RNAi导致种子发芽延迟和寿命延长,但Os-LOX2活性受到强烈抑制的RNAi株系的种子在加速老化后完全失去发芽能力,因此若既要不影响正常条件下种子发芽,又能延缓贮藏中种子的老化进程,适当抑制OsLOX2的表达可能是必要的[79]。另有研究报道,缺失脂氧合酶LOX3的水稻种子在贮藏过程中的抗老化能力比LOX3正常的水稻种子强；OsLOX3反义构建体的转基因水稻种子的胚乳中OsLOX3表达下调、OsLOX mRNA水平显著降低,LOX3的活性即将亚油酸转化为9-氢过氧十八碳二烯酸(9-hydroperoxyoctadecadienoic acid,9-HPOD)的能力显著低于野生型种子,该转基因植株表型和生命周期正常,但种子的贮藏耐性得到改善[80]。

3.3 乙醛脱氢酶基因和醛-酮还原酶基因的功能及其分子作用机制

水稻的乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase 7,OsALDH7)可能通过解毒脂质过氧化产生的醛,从而维持种子活力。OsALDH7的T-DNA插入突变体受非生物胁迫显著影响,突变体种子在干燥和贮藏过程中,胚乳有类黑素(melanoidin)积累；与野生型相比,突变体种子对人工老化处理更敏感,并且积累更多的丙二醛[81]。在种子贮藏过程中脂质过氧化介导产生的还原性羰基化合物(reactive carbonyl compounds,RCC)也是细胞毒性物质之一,其积累会降低种子活力。醛酮还原酶(aldo-ketoreductase,AKR1)对RCC的解毒作用能够延长种子寿命,AKR1过表达的水稻和烟草种子的抗老化能力明显高于野生型[82]。

3.4 L-异戊烯基甲基转移酶基因的功能及其分子作用机制

非生物胁迫会加速细胞内蛋白质中异天冬氨酰(isoAsp)残基的形成,从而影响蛋白质结构和功能。L-异戊烯基甲基转移酶(protein L-isoaspartyl methyltransferase,PIMT)通过将有害的isoAsp残基恢复为功能性天冬氨酰残基来修复其他蛋白质[83]。该酶在植物中有两个不同的编码基因—PIMT1和PIMT2。早在1993年,即有报道PIMT可能与小麦种子的生活力有关[84]。拟南芥种子中PIMT1含量增加可降低蛋白质中isoAsp残基的积累,使种子寿命延长和活力提高；相反,PIMT1含量减少时,新鲜的干燥成熟种子的蛋白质中isoAsp残基的积累量增加,导致种子对老化处理的敏感性提高和在胁迫发芽条件下种子活力丧失[85]。不同PIMT亚型的生化活性有差异,在发育、成熟以及暂时静止状态的正常水稻种子中高活性PIMT是必需的[86]。Wei等[87]从水稻中克隆到两个PIMT基因——OsPIMT1和OsPIMT2,翻译产物OsPIMT2主要存在于绿色组织的叶绿体和细胞核中,而OsPIMT1在种子胚中大量积累；OsPIMT1突变株系的种子对人工老化高度敏感,而过表达株系的种子中减少了isoAsp残基的积累,种子活力增强,人工老化21 d的过表达株系种子的发芽率与野生型相比提高9%～15%；来自OsPIMT1 RNAi株系的种子在胚中过度积累isoAsp残基,种子发芽能力快速丧失。同样,人工老化处理后的鹰嘴豆(Cicer arietinum)种子发芽率显著降低,种子中CaPIMT活性也降低；进一步研究表明,CaPIMT2可使核蛋白中的异常isoAsp残基得到修复,而CaPIMT1主要在细胞质部分修复此类异常蛋白质,从而增强种子活力和寿命[88]。

3.5 生育酚(维生素E)基因的功能及其分子作用机制

生育酚(tocopherols或vitamin E,维生素E)是植物合成的一类亲脂性抗氧化剂,在种子中含量特别高。Simontacch等[89]发现大豆胚轴中α-tocopherol含量随种子所处的外界氧化胁迫条件而发生变化,高活力或抗氧化能力强的种子中α-tocopherol含量也高。Sattler等[90]在拟南芥中分离并表征了两个维生素E基因(VTE1和VTE2),这两个基因的突变都会导致组织中生育酚缺乏；但两者作用机制有区别,vte1破坏生育酚环化酶活性并积累氧化还原生物合成中间产物,而vte2破坏尿黑酸植基转移酶(homogentisate phytyltransferase)的活性,不积累中间产物；与野生型相比,这两个基因中任何一个突变均会导致种子寿命大大降低。

3.6 金属硫蛋白基因和热激蛋白基因的功能及其分子作用机制

金属硫蛋白(metallothioneins,MTs)是一类能够结合金属离子的低相对分子质量、富含半胱氨酸的蛋白质,主要参与生物体内重金属离子的稳态维持和活性氧的清除反应。在植物中,HSPs极其丰富和多样,并且与多种非生物胁迫逆境有关。周玉亮[91]研究莲MTs和HSPs的生物学功能时发现,过表达 NnMT2a、NnMT3或 NnHSP17.5的拟南芥种子与野生型种子相比表现出更强的抵抗人工老化的能力。Yuan等[92]研究发现,在水稻中,Os-MT2b(MET-ALLOTHIONEIN2b)优先在水稻未成熟穗、萌发胚的盾片和侧根原基中表达,且细胞分裂素下调其表达；在OsM-T2b过表达和RNAi转基因植株中,内源细胞分裂素——异戊烯基腺苷(isopentenyladenosine)的含量差异表明,OsMT2b可能通过反馈调节内源细胞分裂素水平而参与水稻根发育和种子胚萌发的调控。

4 展望

在贮藏过程中,种子老化或活力下降是不可避免的,每年农作物种子因老化而给农业生产造成巨大损失[93]。近十多年来,分子生物学技术应用于种子活力或抗老化能力领域的研究,取得了显著进展,越来越多的种子抗老化相关基因得到发掘和克隆。对这些基因的生物学功能、基因之间的相互作用及其分子调控机制的研究,将有助于阐明种子活力或抗老化能力的分子调控机制；在分子设计育种中,通过基因编辑技术对获得的优良基因进行整合和开发利用,可望培育出种子抗老化的农作物新品种,从而确保种质资源的长期保存,以及满足农业生产对高质量种子的需求。