HPLC法同时测定萹蓄药材中8种活性成分的含量*

李 磊

新汶矿业集团有限责任公司中心医院药学部，山东 泰安 271233

萹蓄为蓼科植物(polygonumaviculareL.)的干燥地上部分，全国大部分地区均有种植，夏季叶茂盛时采收，去除根和杂质，晒干即可用于临床。萹蓄药材始载于《神农本草经》，现2015年版《中国药典》收录，是一味常用中草药，常用于热淋涩痛，小便赤短，虫积腹痛，皮肤湿疹等症[1-2]。萹蓄的主要化学成分有黄酮类、酚酸类、苯丙素类、生物碱类、萜类等，目前对萹蓄的质量控制研究主要集中在黄酮类和酚酸类化合物中，但同时测定萹蓄中理化性质相差较大的几种活性组分含量的研究报道较少[3-10]。为了全面控制萹蓄的质量，本研究采用HPLC法，首次建立了一次进样同时测定萹蓄药材中绿原酸、咖啡酸、杨梅苷、金丝桃苷、木犀草苷、槲皮苷、槲皮素、山奈素等8种成分含量的方法，以期为萹蓄药材的合理质量控制提供相关科学依据。

1 仪器和试药

1.1 仪器

Agilent 1100 高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；GR-202 型电子分析天平(日本And公司，精确到0.1 mg)；移液器(德国Eppendorf公司)；KQ-500型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；HH 恒温水浴锅(江苏金坛国胜实验仪器厂)；Ultimate XB-C18色谱柱(上海月旭Welch)。

1.2 试药

槲皮素(批号AB17051802)、绿原酸(批号AB7070302)购自成都埃法生物科技有限公司；槲皮苷(批号wkq17081106)、杨梅苷(批号wkq17090808)、木犀草苷(批号wkq17070401)购自四川维克奇生物科技有限公司；咖啡酸(批号110885-200102)、金丝桃苷(批号111521-201205)、山奈素(批号11861-200606)购自中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯，乙醇、磷酸为分析纯，超纯水。

三个批次萹蓄药材产自河北保定，购自泰安市漱玉平民大药房，由山东第一医科大学(山东省医学科学院)孙立彦教授鉴定为蓼科植物萹蓄(polygonumaviculareL.)的干燥地上部分。

2 方法与结果

2.1 标准品溶液制备

精密称取各标准品适量，纯甲醇溶解制成含槲皮素2 mg/mL、金丝桃苷1 mg/mL、木犀草苷100 μg/mL、绿原酸1 mg/mL、山奈素 1 mg/mL、咖啡酸1.55 mg/mL、槲皮苷2 mg/mL、杨梅苷2 mg/mL的标准品贮备液，然后都用纯甲醇稀释配制6个标准品系列质量浓度。8种标准品贮备液各取50 μL，用纯甲醇稀释至1 mL，即得混合标准品溶液。

2.2 样品溶液制备[2-5]

3批药材样品磨碎、过四号筛，各精密称取0.5 g置于50 mL具塞锥形瓶中，分别加入60%乙醇25 mL，称定质量，冷浸 6 h，超声30 min，60%乙醇补足减失的质量，摇匀，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得样品溶液。

2.3 色谱条件

Ultimate XB-C18色谱柱(4.6 mm× 250 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-0.5%磷酸(B)，梯度洗脱(程序见表 1)；柱温45 ℃；体积流量 1.0 mL/min；检测波长360 nm；进样量10 μL。HPLC色谱图见图1。

2.4 线性关系考察

将标准品溶液在“2.3”项色谱条件下测定，记录色谱图。以标准品溶液质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，将标准品溶液逐级稀释，以 3倍信噪比确定检测限，计算绿原酸、咖啡酸、杨梅苷、金丝桃苷、木犀草苷、槲皮苷、槲皮素、山奈素等8种化合物的回归方程，结果表明各化合物的峰面积和质量浓度之间均呈现良好的线性关系。见表2。

2.5 精密度试验

取同一批标准品溶液，在“2.3”项色谱条件下进样6次，测得绿原酸、咖啡酸、杨梅苷、金丝桃苷、木犀草苷、槲皮苷、槲皮素、山奈素等峰面积RSD分别为0.58%、0.75%、0.36%、0.84%、0.64%、0.81%、0.43%、0.56%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

将样品溶液在室温下于 0、1、2、4、6、8、12、24 h进样测定，测得绿原酸、咖啡酸、杨梅苷、金丝桃苷、木犀草苷、槲皮苷、槲皮素、山奈素峰面积RSD分别为0.46%、0.35%、0.56%、0.73%、0.62%、0.72%、0.85%、0.51%，表明样品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

分别取同一批萹蓄，按“2.2”项下方法制备 6份样品溶液，测得绿原酸、咖啡酸、杨梅苷、金丝桃苷、木犀草苷、槲皮苷、槲皮素、山奈素等峰面积RSD分别为1.24%、2.08%、1.76%、1.21%、2.59%、2.81%、3.26%、2.67%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密称取已知含量的萹蓄粉末6份，每份约 0.5 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入适量标准品溶液，按“2.2”项下方法制备样品溶液，测定加样回收率。结果见表3，符合分析要求。

2.9 样品含量测定

用“2.2”制备的样品溶液，按“2.3”条件进行HPLC分析，测定各指标成分的峰面积并计算含量，有关数据见表4。

表1 梯度洗脱程序

图1 混合标准品和样品的HPLC谱图

表2 回归方程及相关系数

表3 加样回收率试验结果(n=6)

续表

表4 萹蓄中8种成分含有量检测结果(%)

3 讨 论

本研究对萹蓄药材中的8种药效成分进行了分析检测，其中包括黄酮类化合物和酚酸类化合物，是首次对萹蓄中理化性质相差较大的几种活性组分含量的研究。对不同流动相进行了考察，包括甲醇-0.2%磷酸水和乙腈-0.5%磷酸水，最后确定乙腈-0.5%磷酸水及梯度洗脱条件。

2015年《中国药典》萹蓄药材的质控指标仅规定了杨梅苷，本研究也证明杨梅苷是萹蓄中含量最高的有效成分之一，河北保定产3批次萹蓄中杨梅苷含量均高于药典0.03%的要求[1]。除杨梅苷外，本研究还同时检测了萹蓄中其他7种有效成分，为全面评价和研究萹蓄药材质量、保障临床用药安全有效提高了有力支撑。

3批次萹蓄药材中8种有效成分含量比重有差异，但基本一致的是含量最高的为杨梅苷，其次是咖啡酸、槲皮苷和槲皮素，较少的是绿原酸和山奈素，金丝桃苷和木犀草苷微量或者检测不出。原因可能是药材采收期、生长年限、存放条件和时间、取样量部位的不同导致有效成分含量有差异。本次选取的萹蓄都是产自河北保定，产地不同也会导致有效成分含量的差异。而其中某些有效成分检测不出可能因为取样量少不易检测或者在溶媒中溶解性不好。